浅谈氧氟沙星胶囊微生物限度检查方法

氧氟沙星为第 3 代喹诺酮类抗菌药物，对需氧革兰 阴性杆菌、肠杆菌科、假单胞菌属、支原体、衣原体、非典 型分枝杆菌等均有良好的抗菌活性，尤其对需氧革兰阴 性杆菌的抗菌活性最强。对氧氟沙星胶囊进行微生物限 度检查时，需要消除样品的抑菌活性，真实地反映其微 生物污染情况，防止出现假阴性检查结果。

菌种 : 金 黄 色 葡 萄 球 菌 ( Staphylococcus aureus) [CMCC( B) 26003 ]、铜绿假单胞菌( Pseudomonas aeruginosa) [CMCC( B) 10104]、枯 草 芽 孢 杆 菌 ( Bacillus subtilis) [CMCC( B) 63501 ]，白色念珠菌( Candida albicans) [CMCC( F) 98001]、黑曲霉( Aspergillus niger) [CMCC( F) 98003]，大 肠 埃 希 菌 ( Escherichia coli) [CMCC( B) 44102]，均购自中国食品药品检定研究院，工作用菌株 均为第 3 代。

仪器: LDZX － 30KBS 型压力蒸汽灭菌器( 上海申安 医疗器械厂) ; XY500JC 型电子天平( 常州市幸运电子设 备有限公司) ; HFsafe － 1800TE ⅡB2 型生物安全柜( 上 海力申科学仪器有限公司) ; BSD － TX345 型台式恒温 振荡器( 上海博讯实业有限公司) ; HH － 系列电热恒温 水浴锅( 北京科伟永兴仪器有限公司) ; LRH － 250F 型 生化培养箱、MJ-250F型霉菌培养箱(上海一恒科学仪 器有限公司); FC752 型薄膜过滤器( 杭州泰林生物技术 设备有限公司，批号为 20160102) 。 试药: 氧氟沙星胶囊( 某制药公司，批号为 150801， 规格为每粒 0． 1 g) ; 胰酪大豆胨琼脂培养基( 批号为151107) 、沙氏葡萄糖琼脂培养 基( 批 号 为 150824) 、 胰酪大豆胨液体培养基( 批号为 151114) 、沙氏葡萄糖 液体培养基( 批号为 1505252) 、蛋白胨培养基( 批号为 160119) 、麦康凯液体培养基( 批号为 150911) 、麦康凯 琼脂培养基( 批号为 1504162) ，均购自北京三药科技开 发公司; 氯化钠( 天津市致远化学试剂有限公司，批号为 20160601) ; 氯化镁( 天津市百世化工有限公司，批号为 20150103) 。

将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、 大肠埃希菌的新鲜培养物分别接种于胰酪大豆胨液体 培养基中，35 ℃ 培养 24 h; 将白色念珠菌的新鲜培养物 接种于沙氏葡萄糖液体培养基中，25 ℃ 培养 3 d。上述 培养物用无菌 0． 9% 氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬 液; 将黑曲霉的新鲜培养物接种于沙氏葡萄糖琼脂培养 基上，25 ℃ 培养 7 d 或直至获得丰富的孢子，加入 5 mL 含 0． 05% 聚山梨酯 80 的无菌 0． 9% 氯化钠溶液，洗脱 孢子，收集孢子悬液，用含 0． 05% 聚山梨酯 80 的无菌 0． 9% 氯化钠溶液制成适宜浓度的孢子悬液。

取 供 试 品 10 g，加 含 5% 聚 山 梨 酯 80 的 胰 酪 大 豆胨液体培养基至 100 mL，45 ℃恒温振荡 15 min，制成 1 ∶ 10 ( m / V ) 的供试液 A。取供试品 10 g，加含 5% 聚 山梨酯 80 的胰酪大豆胨液体培养基至 90 mL，再加入 10 mL 1 mol / L 的氯化镁溶液，45 ℃ 恒温振荡 15 min， 制成 1 ∶ 10 ( m / V)的供试液 B。

需氧菌总数计数方法: 采用薄膜过滤法。试验组，取 2． 2 项下供试液 A、供试液 B 各 1 mL，置含 100 mL 1% 聚山梨酯 80 的 0． 1% 蛋白胨水溶液的薄膜过滤器中， 滤过，用含 1% 聚山梨酯 80 的 0． 1% 蛋白胨水溶液分别 试验冲洗 5 次、8 次，每次 100 mL。在最后一次冲洗液中 分别加入菌落数不超过 100 cfu / mL 的金黄色葡萄球 菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉 试验菌液各 1 mL。制备好的滤膜，菌面朝上，贴于胰酪 大豆胨琼脂培养基平板上。供试品对照组，取制备好的 供试液，以稀释液代替菌液，同试验组操作。菌液对照 组，取不含中和剂的相应稀释液替代供试液，按试验组 方法操作。中和剂对照组，取相应量稀释液替代供试品， 同试验组方法操作。各组每株菌平行制备 2 皿，30 ～ 35 ℃ 培养 2 ～ 3 d。计算平均菌落数。霉菌和酵母菌总数计数方法: 采用平皿法。试验组，取 2． 2 项下供试液 A 分装于 2 个无菌试管中，每管装量 9． 9 mL，再分别加入制备好的含菌量不大于 104 cfu / mL的白色念珠菌、黑曲霉试验菌液各 0． 1 mL。取制备好的 试验组样品液 1 mL，置直径为 90 mm 的无菌平皿中，注 入温度不超过 45 ℃ 熔化的沙氏葡萄糖琼脂培养基约 20 mL，混匀，凝固，每株菌平行制备 2 皿，20 ～ 25 ℃ 培 养 3 ～ 5 d。同法测定供试品对照组、菌液对照组及中和 剂对照组，并计算各组的平均菌落数。

氧氟沙星胶囊对霉菌和酵母菌抑制作用较弱，因此 霉菌和酵母菌总数采用常规平皿法即可。在预试验中， 需氧菌以常规法试验，供试液稀释到 1 ∶ 100( m / V) 时， 金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的回收 比值皆为 0。由此可见，氧氟沙星胶囊对细菌有很强的 抑菌活性，遂在薄膜过滤法过程中采用了最后一次冲洗 时加入试验菌的方法，并取制备的 1 ∶ 10 供试液 1 mL 或 10 mL 加入含 100 mL 冲洗液滤器中，混匀后过滤，可有效防止药物颗粒堵塞薄膜。在中和剂的选择上，第一， 氧氟沙星胶囊有较强的抑菌活性，首选添加聚山梨酯80，因为一定浓度的聚山梨酯 80 能促进胶囊剂的乳化 与分散，并对抑菌活性有中和作用; 第二，氧氟沙星胶囊 为喹诺酮类抗菌药物，可与金属离子( Ca2 +，Mg2 +，Fe3 +， Al 3 + ) 发生络合反应，使抗菌活性下降。



 

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