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生化培养箱在乳酸菌的分离与鉴定的使用

返回列表 来源:未知 发布日期:2019-08-30 15:11【

泡菜是一种传统发酵食品,可以多种蔬菜为主要 原料,经过发酵制成。因其操作简单,风味独特,品种 多样,且具有良好的口感而深受大众的喜爱。在我国, 主要以四川泡菜最为出名,其产品销量位居全国第 一。据不完全统计,2009 年四川泡菜产量就已经达到 了 120 万吨,产值 90 亿元。有研究表明,泡菜中存在 着多种乳酸菌,如植物乳杆菌、肠膜状明株杆菌和短 乳杆菌等。乳酸菌不仅是泡菜发酵中最主要的菌群, 还是其独特风味品质的良好来源。



1 材料与方法

1.1 材料与试剂


豇豆、食盐:襄阳市襄城区鑫源超市;泡菜坛子:淄 博海沃家具专营店;石蕊牛乳培养液:湖北文理学院食品科学技术学院实验室自制;MRS 培养基 [蛋白胨、 牛肉膏、酵母膏、琼脂(均为生物试剂)、乙酸钠、柠檬酸 二胺、磷酸氢二钾、葡萄糖(均为分析纯)]、甘油,氯化 钠,磷酸,磷酸二氢钾:均为分析纯,国药集团化学试剂 有限公司;鲊广椒样品:从恩施州咸丰地区农户家中 采集了 5 份不同来源的鲊广椒样品,装入无菌样品瓶, 并使用样品箱迅速带回实验室。



1.2 主要仪器

LRH-150 生化培养箱:上海一恒科学仪器有限公 司;LXJ-IIB 型低速大容量多管离心机:上海安亭科学仪器厂;SA402B 味觉分析系统 (该系统包含 AAE、 CTO、CAO、COO、AEI 等 5 个测试传感器,2 个参比传 感器):日本 Insent 公司;PEN3 电子鼻:德国 Airsense 公司;LC202ADXR高效液相色谱仪:日本岛津公司;KH100DY 超声波清洗机:昆山禾创超声仪器有限公司。



1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的分离及纯化


从采集到的 5 份恩施州咸丰地区鲊广椒中进行乳 酸菌的分离:首先取样品 2 g 加入到 15 mL 无菌的石 蕊牛乳培养基中,37 ℃培养 48 h,然后用生理盐水将 石蕊牛乳培养液稀释至梯度为 10-5、10-6 和 10-7,涂布 到含有 1 %碳酸钙的 MRS 培养基中,置于厌氧工作站 中 37 ℃培养 2 d。根据菌落的形态特征,挑选产生透明 圈的菌株,进行革兰氏染色与过氧化氢酶试验。将具 有透明圈、革兰氏阳性且过氧化氢酶阴性的菌作为待 定的乳酸菌在 MRS 平板上进行连续划线分离纯化,将 纯化后的菌株使用 30 %的甘油于-80 ℃超低温冰箱中 保存。



1.3.2 乳酸菌的鉴定

具体方法参照王丹丹等的方法。即将纯化后的 乳酸菌接入 MRS 培养基中收集菌体,进行菌株 DNA 的提取,然后以提取的 DNA 为模板应用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术,将扩增后得 到的产物连接载体和克隆进行基因组的测序,将测序 后获得的乳酸菌 166S rRNA 序列在 NCBI 的 GenBank 中进行 Blast 比对,选取同源性较高的菌作为模式菌 株,构建乳酸菌分离菌株系统发育树,确定所分立的 乳酸菌的系统分类地位。



1.3.3 泡菜的制作方法

泡菜制作的工艺流程:豇豆→清洗→沥干→装 坛→加入盐水→接种→发酵→产品检测。具体操作 为,菌种的准备:将分离并鉴定的乳酸菌使用 MRS 液 体培养基连续活化 3 代,并使用生理盐水重悬。配制 盐水:按照每升水称取 40 g 食盐的比例溶解、煮沸、冷 却晾凉;选材:豇豆无虫蛀,硬度好;装坛:称取豇豆 250 g,切成 5 cm 小段,装入坛中,再加入晾凉的盐水 635.5 mL;接种:按照 1 %添加量接入所分离的乳酸 菌;发酵:将装坛并接种了乳酸菌的坛子在 25 ℃条件 下放置 7 d。



2 结果与讨论

从 5 份恩施州咸丰地区鲊广椒中一共分离出 44 株细菌。在厌氧工作站经含有碳酸钙的 MRS 培养基中 培养后,将观察到菌落的周围存在透明圈,革兰氏染 色呈阳性,且过氧化氢酶试验呈阴性的菌株初步确定 为乳酸菌,共有 20 株,将它们进行纯化与保存。部分 乳酸菌的菌落与细胞形态见图 1。



将得到的 20 株乳酸菌提取基因组 DNA,并通过 PCR 与测序,获得它们的 16S rRNA 序列后,在 Gen- Bank 数据库进行 BLAST 比对,比对结果显示这些菌 株的序列均与植物乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)、 戊糖乳杆菌 (Lactobacillus pentosus) 及类植物乳杆菌 (Lactobacillus paraplantarum)的模式菌的 16S rRNA 序 列之间的相似度均达到 99 %以上。从 NCBI 数据库提 取相似度较高的模式菌的 16S rRNA 基因序列,使用 MEGA7.0构建系统发育树进行系统发育分析。2 发酵不同泡菜挥发性风味的分析 电子鼻是一个模仿生物嗅觉的系统,能够对大多 数挥发性成分的气体进行分析和检测,主要由三部分 组成:气体流量系统、传感器组和分析控制软件。其中 传感器组是由 10 个金属氧化气体传感器组成,分别为 W1C、W5S、W3C、W6S、W5C、W1S、W1W、W2S、W2W、 W3S。不同的传感器能够对不同种类的气味物质做出 响应,并且不受到主观因素的影响,因此可以用来对 食品的气味做出客观的评价。泡菜的口感是泡菜品质的重要体现,一般来说, 酸辣可口,同时苦涩味较少的泡菜的品质较好。为确 定分离到的乳酸菌的泡菜发酵特性,采用电子舌技术 对泡菜水样品的滋味指标进行了评价。

3 结论


从湖北恩施州咸丰地区采集的 5 份鲊广椒样品中 共分离得到了 20 株乳酸菌,均鉴定为植物乳杆菌。使 用所分离到的乳酸菌进行了豇豆泡菜的发酵制作,并 对豇豆泡菜水品质进行了品质评价,结果显示使用乳 酸菌 HBUAS51141 和 HBUAS51156 发酵的泡菜水中 乳酸含量高达 9.20 g/L 以上,同时苦涩味较轻,是豇豆 泡菜复合发酵剂开发的优良候选菌株。






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