喹诺酮类药物耐药表型分析(一恒培养箱使用)

肺炎克雷伯氏菌( Klebsiella pneumoniae) 是毛皮动 物养殖业常见的病原菌之一，该菌主要引起毛皮动物 的肺炎、子宫炎及其他化脓性炎症等，其发病率也呈 逐年上升趋势，仅次于大肠杆菌( Escherichia coli) 感 染，发病率和死亡率均较高，严重影响着毛皮动物养 殖业的发展。肺炎克雷伯氏菌广泛分布于动物呼 吸道、消化道、泌尿生殖道以及水和土壤中，该菌可 引起欧洲水貂( Mustela lutreola) 、貉( Nyctereutes procyonoides) 、狐( Vulpes spp. ) 、牛、羊等多种动物及人 ( Homo sapiens) 发病，是一种重要的人畜共患的条件 致病菌。相关研究表明肺炎克雷伯氏菌通过接合， 转化和转导等形式对多种抗生素产生很强的耐药性， 并且在同种菌株间进行传播，使其耐药性扩散到其他 菌株中，致使该菌呈现多重耐药性。目前，关于肺 炎克雷伯氏菌耐药性的报道逐渐增多，应该引起重视。

1 材料与方法

1. 1 材料

1. 1. 1 菌株

24 株貉源致病性肺炎克雷伯氏菌临床分离菌株， 由河北省预防兽医重点实验室保存。

1. 1. 2 主要试剂与仪器

营养琼脂、营养肉汤、麦康凯肌醇阿东醇羧苄青 霉素培养基( MIAC) 均购于北京陆桥生化试剂有限公 司; 左氧氟沙星、恩诺沙星、诺氟沙星、环丙沙星药 敏纸片均购自北京天坛药物生物技术开发公司; DNA Marker 2000 购于北京中科瑞泰生物科技有限公司; 2 × ES Taq Master Mix、ddH2O 均购自北京康为世纪生 物科技有限公司; 梯度 PCＲ 仪由德国 eppendorf 公司 生产; 隔水式恒温培养箱由上海一恒科学仪器有限公司生产; 常用的试剂和仪器设备由本实验室提供。

1. 2 方法

1. 2. 1 菌种复苏

将保存于 － 80 ℃的致病性肺炎克雷伯氏菌接种于 麦康凯肌醇阿东醇 羧 苄 青 霉 素 培 养 基 ( MIAC) 上， 37 ℃恒温培养 12 h，挑取单个菌落于装有 5 mL 营养 肉汤的 10 mL 管中，37 ℃进行扩大培养至对数期。

1. 2. 2 药敏试验

取对数期的菌株，调整菌液浓度为 106 CFU/mL， 参照 CLSI( Clinical and Laboratory Standards Institute) 推荐的 K-B 药敏纸片法对 24 株致病性肺炎克雷伯氏菌 进行药物敏感性试验，抑菌圈直径结果判断以细菌敏 感( sensitivity，S) 、中介( intermediate，I) 、耐药( resistance，Ｒ) 表示。

1. 2. 3 细菌基因组

DNA 的提取 利用水煮法提取，取菌液 1 000 μL 离心，水洗两遍，加 200 μL 无菌水放入水浴锅 100℃，10 min，取 出后离心 12 000 r/min，10 min 留上清液，备用。

1. 2. 4 引物设计

设计喹诺酮类耐药基因的引物，由上海生工生物工程有限公司合成。

1. 2. 5 耐药基因的 PCＲ 检测

以提取的 24 株貉源致病性肺炎克雷伯氏菌临床 分离菌株基因组 DNA 为模板对 9 种喹诺酮类药物的 耐药基因用降落 PCＲ 进行检测。反应体系( 50 μL) : 2 × Es Taq Master Mix 20 μL，上、下游引物各 2 μL， DNA 模板 4 μL，ddH2O 12 μL; 反应条件: 预变性: 94℃5 min，94℃ 变 性 30 s，退 火 ( 见 表 1 ) ℃ 45 s， 72℃延伸 70 s，72℃ 终 延 伸 10 min，30 Cycles。用 1% 的琼脂糖凝胶电泳检测目的条带，将检测结果为 阳性的菌株的 PCＲ 产物送往上海生工生物工程有限公 司进行测序，测序结果与 GenBank 中登录的参考株进 行同源性比对。

1. 2. 6 数据分析与统计

将 24 株貉源致病性肺炎克雷伯氏菌临床分离菌 株对喹诺酮类药物耐药性与携带耐药基因进行统计， 分析其相关性，计算其符合率。

2 结果与分析

24 株致病性肺炎克雷 伯氏菌对 4 种抗生素有很强的耐药性。其中左氧氟沙 星的耐药性、恩诺沙星与环丙沙星耐药性均为 79. 2% ( 19 /24) ，诺氟沙星耐药性为 75% ( 18 /24) 。临床分离的 24 株致病性肺炎克雷伯 氏菌的菌株表现多重耐药现象，耐 4 种抗生素的分离 菌株数最多有 16 株，占分离菌株的 66. 7% ; 耐 3 种抗 生素的分离菌株有 2 株，占分离菌株的 8. 3% ; 耐 2 种 抗生素的分离菌株有 3 株，占分离菌株的 12. 5% ; 耐 1 种抗生素的分离菌株有 1 株，占分离菌株的 4. 2%，2 株未产生耐药性，占分离菌株的 8. 3%。24 株致病性肺炎克雷伯氏菌的分离 菌株均含有多重耐药基因，其中含有 9、8、5、3 种 耐药基因的分离菌株各 1 株，占分离菌株的 7. 7% ; 含有 7 种耐药基因的菌株为 10 株，占分离菌株的 76. 9% ; 含有 6 种耐药基因的菌株有 6 株，占分离菌 株的 46. 2% ; 含有 4 种耐药基因的菌株有 4 株，占分 离菌株的 30. 8% 。

3 讨论

肺炎克雷伯氏菌属于克雷伯氏菌属一种革兰氏阴 性菌，该菌主要分为有肺炎克雷伯菌肺炎亚种、肺炎 克雷伯菌鼻硬结亚种、肺炎克雷伯菌臭鼻亚种 3 个亚 种，其中肺炎克雷伯菌肺炎亚种是临床中常见的病原菌。肺炎克雷伯氏菌主要引起毛皮动物的肺部感 染，造成严重呼吸道症状，同时还可以破坏其免疫系 统，导致免疫器官化脓，降低其免疫力，继发其他的 病原感染，其死亡率高达 80% 以上，成为引起毛皮动 物肺炎主要病原菌之一。国内许多研究报道了随 着抗生素的广泛应用，肺炎克雷伯氏菌对各类抗生素 产生了较为严重的耐药性。本试验研究表明，临 床分离的 24 株貉源致病性肺炎克雷伯氏菌对喹诺酮 类药物左氧氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星 出现严重的耐药性，其耐药性为 70. 8% —79. 2% ，且 呈现多重耐药性，其中耐 4 种抗生素的菌株有 16 株， 占分离菌株的 66. 7% 。说明了临床分离的 24 株貉源 致病性肺炎克雷伯氏菌对喹诺酮产生很强的耐药性， 可能由于临床中不合理使用喹诺酮类药物造成的，应 该引起重视。与韩坤等、李巧玲等、胡伟等报道的存在一定的差异性，可能与肺炎克雷伯氏菌感 染的宿主( 蓝狐( Vulpes lagopus) 、水貂、人) 不同，对 喹诺酮类药物敏感性不同，还可能与地区有关。



 

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