生物样本库标准化建设与意义

生物样本库是一种集中保存各种人类生物材 料，用于疾病的临床治疗和生命科学研究的生物应 用系统。基于收集高质量的结缔组织病组织及以血 液、尿液为主的体液样本是发现风湿免疫病遗传生 物标志物及药物作用新靶点的物质基础。生物样本 资源的重要性已经得到充分的认识和广泛的重 视。

1 材料与方法

1. 1 材料

1. 1. 1 病例选择

所有病例均来源于在我院门诊 及住院风湿病患者，原则上，所有风湿免疫病均具备 入库资格，但基于我院实际情况，我们重点采集系统 性红斑狼疮( systemic lupus erethematosus，SLE) 、骨 性关节炎( Ostoarthritis，OA) 、类风湿关节炎( rheumatoid arthritis，ＲA) 、骨质疏松症、强直性脊柱炎、干 燥综合症、系统性血管炎、未分化结缔组织病 8 个病 种。所有患者诊断均符合各个病种诊断及治疗指 南。所有入组患者均填写详细问卷，包括一般人口 学、疾病、流行病学、家系等资料。

1. 1. 2 主要设备

4 ℃ 冰箱( 579L，青岛海尔集 团) ，－80 ℃ 冰箱( DW-86L-286，青岛海尔集团) ，台 式离心机( 600C，北京白洋医疗器械有限公司) ，Ｒeal-time PCＲ 扩增仪( ABI7300，美国 Thermo Fisher 公 司) ，紫 外/可 见 光 光 度 计 ( NanoDrop 2000，美 国 Thermo Fisher 公司) ，电热恒温水箱( CU-420 型，上海一恒科学 仪 器 有 限公司) ，贝 迪 打 印 机 ( BPIP300，美国 BＲADY 公司) ，液氮罐( YDS-65-216，成 都金凤液氮容器有限公司) 、－ 20 ℃、－ 4 ℃ 冰 箱 ( BCD-257SL，青岛海尔集团) 、凝胶电泳分析系统 ( GDS-8000，英国 UVP 公司) 。另设 PCＲ 室、分子生 物室、血清室等用于提取核酸，分离淋巴细胞，进行 PCＲ 扩增等分子生物学相关研究。

1. 2 方法

1. 2. 1 人员配置与建库流程

参照上海交通大学 医学院附属仁济医院风湿科生物样本库的建设模 式，参考生物样本库国际规范和指南标准化建设。结合医院自身特点，我院生物样本库组织架 构主要由以下部分组成: 执行委员会、学术委员会、 伦理委员会、质控小组等。在此基础上安排科研助 理专员、质控专员分别负责样本的采集和前处理、核 酸蛋白提取和质量管理、样本信息数据管理、样本出 入库和常务管理等，并按照岗位职责的不同给予相 应的培训内容、方式、要求和频率，定期参加生物样 本库标准化建设会议。

1. 2. 2 伦理规范

收集生物样本库样本必须先征 得患者的知情同意并签署知情同意书。同时经过我 院伦理委员会审查，严格保护患者隐私和权益。

1. 2. 3 组织样本的采集和处理

1. 2. 3. 1 血液样本的采集与保存

血清、血浆、全 血( 用于备提 ＲNA，DNA 和外周血单个核细胞等) 。 血液样本采集选用风湿病患者外周静脉采血，采集 方案选择应遵循不同项目方案，成人捐献者采集量 一般为 10～15 mL，其中 10 mL 抗凝管，5 mL 促凝管。 血清样本使用标准真空负压采血管，常温直立静置 30 min，待血液凝固析出血清，分管，标记，入库。全 血采集至抗凝管充分颠倒混匀后，分装分离血浆和 白细胞，标记，入库。血浆留取后分管，标记，入库， 剩下部分用于分离粒细胞、外周血单个核细胞等，提 取后标记，入库。核对样本标签编号后入库－80 ℃ 冰箱或液氮罐保存。

1. 2. 3. 2 尿液样本的采集与保存

尿液采集相对 简单，尿液是蛋白质、代谢物的主要来源之一。我们 收集风湿病患者晨尿或随机尿液、24 h 尿液。单次 尿液采集量 50 mL。根据研究目的和用途，可分为 混匀尿、尿液上清和尿沉渣。采集后标记，入库，将冻 存管装盒后根据系统分配位置冻存于－80 ℃冰箱中。

1. 2. 3. 3 唾液样本的采集与保存

目前采用唾液 采集管( Salivette) 采集唾液后离心获得样本，常温保 存，采集后的唾液根据标准操作规程进行直接分装 或低速离心，产生的上清和沉淀分别单独保存。唾 液样本建议 500 μL /管分装。若需长期保存可进行 冻存( －80 ℃ 保存) 。该样本与尿液一样属于无创 性操作，简单易行，目前国内罕见有生物样本库存储 此类样本，开发用于唾液收集和基于 SOPS 标准对 于建立一个新的唾液生物样本库至关重要。

1. 2. 3. 4 关节液样本的采集与保存

多种风湿病 发病以关节滑膜增生为主要病理基础，患者常伴有关节肿胀，所以，采集关节液对关节局部炎症等病变 分析有重要作用。通过门诊或住院医师无菌操作取 得关节液，抽出液体后，要记录液体数量，样本库留 取样本分装在 2 支无菌采集管内，其中一个管不加 抗凝剂，另一个管加适量肝素抗凝用做细胞学检查; 将样本贴好标识码标签，－80 ℃保存。

1. 2. 3. 5 粪便样本的采集与保存

多种风湿病发病与肠道菌群失调相。因此，风湿 病专病样本库样本也纳入了粪便采集。测定肠道菌 群一般常用 16SrＲNA 基因序列分析技术检测，因 此，选择灭菌封口特定容器，收集 2～5 g 或 2～5 cm3 固态状( 或 2～5 mL 液态状) 新鲜粪便，无须离心，样 本分管贴好标识码标签，－80 ℃ 保存。如果需要测 定代谢物则将上法采集新鲜粪便用研钵研碎混匀， 取 0. 5 g，置于 50 mL 离心管中，加入 10 mL75%甲醇 溶液，离心取上清液，加入 10%氨水备用，采用气相 色谱-质谱联用法分析。

1. 2. 3. 6 DNA /ＲNA 的提取

按试剂盒要求提取 DNA; ＲNA 的提取选用传统的 Trizol 法，标记，入库， 分别储于－80 ℃冰箱和液氮罐。在样本收集到入库 整个过程中，对从样本中提取的 DNA/ＲNA 样本，需 定期抽查浓度、纯度，鉴定合格后可继续保存。所有 样本应避免反复冻融。

1. 3 临床资料库建立与信息采集系统管理

样本 库管理软件采用 IBIO-GENE V2. 2. 49. 0 版本，通过 与医院信息系统( hospital information system，HIS) / 实验室信息系统( laboratory information system，LIS) / 广东省 医 疗 机 构 病 案 统 计 管 理 系 统 ( Guangdong Province medical institutions health record and statistics，MIS) 对接，利用存储设备，完善管理( 包括样本 采集、患者信息、设备、实验信息、用户信息、统计辅 助等多方面管理) ，方便数据科研/临床提取及校正， 提高了样本库工作效率。实现对样本状态和使用情 况有序化、权限化、多中心的院级共享安全管理。

1. 3. 1 临床资料库建立与管理

包括: ①临床信息 采集; ②信息整理入库; ③原始纸质临床资料存放与 管理; ④出入库管理; ⑤库存核实; ⑥样本接收、运 输、销毁、安全管理; ⑦云端共享管理。

1. 3. 2 临床信息采集管理

将预录入样本的临床 资料信息包括住院号/门诊号、性别、姓名( 为保护 患者隐私使用英文缩写) 、诊断、家系、个人史、既往 史、病史、实验室报告、药物治疗情况、预后与转归等 所有信息输入信息系统内。

1. 4 质控管理

质控管理包括质控人员管理和样 本质控。生物样本库的质量控制包括流程控制和样 本质量检测。

2 结果

于 2014 年 12 月开始收集 样本，截至 2019 年 7 月 31 日，共计收集风湿免疫病 病例 736 人次及 52 人次健康对照者，主要涉及 8 个 病种，其中 SLE 193 人次，ＲA 149 人次，OA 102 人 次，脊柱关节病 40 人次，骨质疏松症 61 人次，干燥 综合征 52 人次，血管炎 7 人次，结缔组织病 120 人 次。目前收集的 788 人次样本中，男性 233 人次，占 29. 6%; 女性 555 人次，占 70. 4%，收集样本的年龄 最小 11 岁，最大 80 岁。参照 SOPS 标 准，生物样本库中样本的出入库全程实施标准化管 理，必须按二维条形码识别定位归放并由专人负责 管理。使用生物样本必须按照流程进行申请、审批、 取样。在样本出库后管理员需追踪出库样本的基本 试验数据，做到对样本的采集与库中质量的二次监 管。为确保实验室全体员工熟悉生物安全法律、法 规，建立生物安全意识，保证相关工作人员掌握开展 工作必需的生物安全知识和技术，避免实验室感染， 防止实验室事故，生物样本库工作人员需定期接受 安全培训和考核。

3 讨论

SLE，OA、ＲA 等风湿免疫病属于高度异质 性风湿病，发病机制复杂，严重影响国民健康与国家 经济。据统计，美国因此每年造成经济损失多达 3 200亿美元以上。流行病学调查显示，我国仅 ＲA 的发病率达 0. 6% ～ 1. 0%，自身免疫性风湿病患者 人数已超过 1 亿，到 2020 年将达 2 亿; 而临床上 SLE、ＲA 等风湿免疫性疾病目前主要采用抗炎和免 疫抑制方法进行治疗，以糖皮质类激素联合细胞毒 药物为主，不良反应大，感染已成为风湿免疫性疾病 致死的首要因素。因此，寻找风湿免疫病生物标志 物、新的治疗靶向药、中西医结合等方向治疗成为全 球共同关注问题。随着治疗手段不断更新，不同类 型干细胞、富血小板血浆、影响自噬相关通路药物在 OA、SLE 等疾病治疗中应用。专病生物样本资 源是一类重要的生物样本资源，临床科研要验证 医疗精准性，建立生物样本库、干细胞库的作用意义 重大。



 

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