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人肝癌细胞SMCC-7721自噬流的影响分析!!!

返回列表 来源:未知 发布日期:2019-10-08 12:03【

据统计,原发性肝癌发病率在恶性肿瘤中居第 6 位,死亡率居第 4 位,我国肝癌患者死亡人数占全球 一半以上。中医药资源丰富,是治疗原发性肝癌的 手段之一,长期服用毒副作用低。有研究表明,中 药在抑制血管新生、抗凋亡、调节免疫及改善生活质 量等方面发挥了重要的作用。益气化瘀解毒方是 全国名中医潘敏求教授治疗肝癌效验方。我们前期研 究发现,其可下调人肝癌细胞 CXCL12/CXCR4/ CXCR7 趋化因子轴,抑制细胞增殖及迁移,同时能 降低肝癌裸鼠移植瘤血管密度(MVD),抑制低氧诱 导因子-1α(HIF-1α)、血管内皮生长因子(VEGF) 的表达,从而发挥抗肿瘤作用。下调 HIF-1α 能通 过多种途径促进 VEGF 的表达,VEGF 是 PI3K/mTOR 信号通路上游的关键靶点之一,且 PI3K/mTOR 信号 通路是参与细胞自噬的经典途径之一。因此,在前期 实验的基础上,本研究以 PI3K/mTOR 信号通路介导 肝癌细胞自噬性死亡为可能机制,进一步探讨益气化 瘀解毒方抗肿瘤的作用途径,为开发抗肝癌多靶点的 中药新药提供依据。

1 实验材料

1.1 细胞

人肝癌细胞 SMCC-7721,武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 药物

益气化瘀解毒方(黄芪 30 g,白参 10 g,半枝莲 30 g,醋莪术 15 g,甘草 5 g),饮片均购自湖南中医 药大学附属第一医院中药房;索拉非尼,南通飞宇生 物科技有限公司,批号 FY34720409,20 mg/支,含 量≥98%;重楼皂苷Ⅰ,南通飞宇生物科技有限公司, 批号 FY11010222,50 mg/支,含量≥98%;雷帕霉素, 南通飞宇生物科技有限公司,批号 FY3415RKR089, 20 mg/支,含量≥98%。

1.3 主要试剂与仪器

双抗(青霉素-链霉素)、胎牛血清、PBS、DMEM 和胰蛋白酶,Gibco 公司;细胞冻存液,天津灏洋; mGFP-RFP-LC3(LC3 自噬双标腺病毒),汉恒生物; 一抗,Abcam 公司;BSA,华美公司;PVDF 膜, Amersham 公司,HRP 偶联山羊抗鼠、兔 IgG,Sigma 公司。0.22 mm 移液枪(Gilson),细菌滤器(Millipore),无菌盒装吸头(Axygen),一次性离心管(Corning), 细胞培养皿( Nest biotechology ),细胞培养板 (Costar),巴氏吸管(武汉博士德),氨基载玻片(天 津灏洋),爬片(SORFA),培养瓶(Corning),超净 工作台(SW-CJ-1FD,苏州苏洁净化设备有限公司), 离心机(TD5A,长沙英泰仪器有限公司),倒置显微 镜(XDS-1B,重庆光电北京有限公司),恒温水浴锅 (上海一恒科学仪器有限公司),水浴箱(上海一恒科学仪器有限公司),共聚焦显微镜(FV1000,日本 Olympus)。

2 实验方法

2.1 细胞培养

将人肝癌细胞 SMCC-7721 接种于高糖培养液中 (含 10%胎牛血清),置于 90%N2-5%CO2-5%O2 培养 箱培养。

2.2 药物制备

将益气化瘀解毒方饮片煎煮并浓缩至每 1 mL 含 1 g 原药材,滤纸粗滤,将药物按一定比例配制成含 中药的 DMEM 溶液。使用前将药液分别稀释至 5 g/L。 重楼皂苷Ⅰ:将 50 mg 样品溶于 0.25 mL DMSO 中 配制成母液,并将母液溶于 DMEM,配制成 50 mg/L。 索拉非尼:将 200 mg 样品溶于 DMSO,再将溶有索 拉非尼的 DMSO 溶于 DMEM,配制成 6 μmol/L 溶 液。雷帕霉素:将 20 mg 雷帕霉素溶于 DMSO,再将 溶有雷帕霉素的DMSO溶于DMEM,配制成4 μmol/L 溶液。

2.3 分组和给药

实验分为益气化瘀解毒方组、重楼皂苷Ⅰ组、雷 帕霉素组、索拉非尼组和空白对照组。每孔加入已配 制好的药液 2 mL,干预 24 h。 2.4 免疫荧光检测 取贴壁对数生长期的细胞,加入配制好的腺病毒 (1 μL 腺病毒∶1 mL DMEM)1 mL,置于培养箱中 培养 6 h 后加入药物干预,24 h 后,加入预冷多聚甲 醛 2 mL,室温静置 10 min;用吸水纸吸干,滴入荧 光淬灭剂封片,在荧光共聚焦显微镜下观察。

3 统计学方法

采用 SPSS21.0 统计软件进行分析。计量资料以x±s 表示,多组均数间比较采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

4 讨论

全国名老中医潘敏求教授结合其多年临床经验, 将肝癌病因病机总结归纳为“虚”“毒”“瘀”:肝癌 患者常见脘腹胀满、神疲乏力、消瘦、纳呆、大便溏 结等为“脾虚”之症;肝癌病情复杂、发展变化快、 预后差,常合并肝炎、肝硬化等病史,同时多种病理因素夹杂,这些均属中医学“毒”或“癌毒”范畴; 肝癌常见的上腹肿块及肝区固定疼痛等,是“瘀”的 客观表现。癌乃“因虚致癌”,先有正气不足,而后 受外来“邪毒”侵袭,导致毒瘀互结而成,癌变进一 步发展使正气更虚,从而又表现出“因癌致虚”的现 象,血瘀、邪毒、正气虚三者始终并存,互为因果, 恶性循环,贯穿于肝癌整个病程。潘老在此基础上提 出,“健脾理气、化瘀软坚、清热解毒”为肝癌基本 治法,并拟定益气化瘀解毒方为治疗肝癌基础方。方 中重用黄芪、白参,取其健脾益气、扶正固表之功, 并以醋莪术化瘀止痛,半枝莲清热解毒,甘草调和诸 药,全方共奏益气化瘀、清热解毒之效。