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浅谈白色念珠菌生物膜形成因素

返回列表 来源:未知 发布日期:2019-09-09 10:57【

白色念珠菌(Canidia albicans)一种条件治病真 菌,当机体免疫功能下降时,白色念珠菌将大量繁殖 入侵机体细胞导致疾病发生 。菌群与上皮细胞表 面的受体结合并分泌出胞外多糖或蛋白,形成的膜 状物,即生物膜。与浮游细胞相比,生物膜将自身包 裹在自发粘附的多糖和蛋白质层中,使白色念珠菌 粘附到表面,可防治药物的杀菌作用 ,具有抵抗更 高水平的抗真菌剂的能力,并且可以产生对常用治 疗的耐受性 。生物膜的形成是白色念珠菌产生耐 药性的主要原因之一 。因此,筛选生物膜抑制剂的 研究方向具有很大意义。



1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验仪器


高速冷冻离心机,高压灭菌锅,电子天平,96 孔 板,恒温振荡仪,酶标仪



1.1.2 菌株来源

致病菌株:白色念珠菌 ATCC 64550(Canidia al⁃ bicans ATCC 64550),购于美国典型培养物保藏中心 ATCC。拮抗菌株:放线菌菌株 TRM43355 分离于新 疆阿拉尔市塔克拉玛干沙漠的流动风沙。



1.1.3 实验培养基及试剂

高氏一号培养基(1 L);AM6 培养基(1 L);YPD 培养基;SDB培养基,培养见《微生物实验指导》。 试剂:(NH4)2SO3;CuSO4·5H2O;FeSO4·7H2O;Mn⁃ SO4·H2O;ZnSO4·7H2O;CH3OH。



1.2 方法

1.2.1 放线菌


TRM43355 的分类学鉴定 根据张仁文等报道的用酶解法提取链霉菌基 因组总DNA并进行16S rRNA基因的PCR扩增,并委 托上海生物工程有限公司测序。使用 EzTaxon 数据 库与来自最密切相关的链霉菌属物种的序列进行多 重比对,以及序列相似性的计算。通过 MEGA 软件 中 邻 接 法(Neighbor - Joining,NJ)构 建 系 统 发 育 树 ,明确其分类学地位。



1.2.2 菌株TRM43355发酵液的制备

将放线菌菌株 TRM43355 接种于高氏一号固体 培养基于 37 ℃培养 5-7 d。将单菌落接种于 AM6 液 体发酵培养基,每瓶 150 mL,37 ℃,180 r/min 振荡培养 7-10 d。发酵液用纱布过滤,除去大颗粒的菌体, 再用 50 mL 离心管,10000 r/min 离心 10 min,以备后 续使用。



1.2.3 菌株TRM43355发酵液粗提物制备

将发酵液分别通过D-101大孔树脂吸附 ,分别 用 30 %、50 %、70 %、95 %甲醇洗脱,收集不同阶段 组分,膏状 50 ℃烘干备用。称取适量浸膏用 5 % DMSO溶解,过0.22 µm无菌微孔滤膜,-20 ℃待用。



1.2.4 菌株TRM43355发酵液粗蛋白提取

将放线菌菌株 TRM43355 的发酵液用纱布过滤 后,10000 r/min 离心 10 min,收集上清,再按 70 %的 浓度加入饱和硫酸铵 ,置于搅拌 30 min,4 ℃静置 过夜,10000 r/min 低温高速离心 15 min,收集沉淀。 用少量 PBS(磷酸盐缓冲液)溶解沉淀,用 MW8000- 10000 的透析袋4 ℃透析48 h。奈氏试剂检测透析液 中的 NH4+ 是否残留。将无残留 PBS溶解的粗蛋白溶 液冷冻抽干,存放-20℃备用。



1.3 活性检测

1.3.1 不同蛋白浓度对白色念珠菌生物膜形成能力的影响


采用微孔板半定量方法 检测蛋白对念珠菌生 物膜形成能力的影响。用 PBS 配制蛋白母液浓度为 2 mg/mL,经过 0.22 µm 微孔滤膜过滤,置于 96 孔板 中,进行倍性稀释,获得蛋白浓度为 1000~3.91 μg/ mL 检测不同蛋白浓度对白色念珠菌生物膜形成 能力的影响。



1.3.2 菌株TRM43355 发酵液产物和粗蛋白对白色念珠菌生物膜形成能力的影响

取 100 μL 的菌株 TRM43355 发酵液分段产物溶 液(30 %、50 %、70 %、95 %不同甲醇相组分浸膏)和 100 μL 的菌液(将培养 72 h 白色念珠菌菌液按 1:10 稀释,菌液浓度为 1.205×107 CFU/mL)加至 96 孔板 中,混匀,4 个孔为一组平行实验。37℃培养箱静置 培养 72 h 后用酶标仪检测生物生长量,蒸馏水冲洗 三次,洗去未黏附的浮游真菌,60 ℃烘箱1 h,用0.5% 结晶紫染色5 min,用蒸馏水冲洗后室温下自然晾干, 用酶标仪测定ATCC 64550白色念珠菌生物膜形成能 力,相对生物膜形成能力=(处理组 OD490/空白对照OD490)×100。



2 结果与分析

TRM 43355经过16S rRNA基因序列比对分析结 果表明此菌株属于链霉菌属,与数据库中Streptomyces barkulensis RC 1831T 具 有 最 高 相 似 性 ,相 似 度 为 99.06%。与其它链霉菌属种亲缘关系如图1所示。



使用微孔板半定量法检测发酵液的提取物对白 色念珠菌ATCC 64550生物膜形成的影响。菌株 TRM 43355 的粗蛋白对白色念珠菌生物膜 形成具有很好的抑制效果,抑制率高达 88.12 %,其 70 %、95 %甲醇洗脱分子的活性也比较显著。后续 实验就放线菌 TRM 43355发酵液中的粗蛋白深入研 究。为了确定菌株 TRM 43355 发酵液中蛋白对白色 念珠菌生物膜形成的最小抑膜浓度,用不同浓度蛋 白,采用微孔板定量法测试活性。粗蛋 白浓度为 2 mg/mL 时对白色念珠菌生物膜形成抑制 率为 93%。当蛋白浓度 0. 25 mg/mL、0. 5 mg/mL 和 1 mg/mL 时相对生物膜形成能力分别为 96. 31 %、 82. 98 %和86. 89 %,当蛋白浓度为 2 mg/mL、2. 5 mg/ mL 和 3 mg / mL 时 相 对 生 物 膜 形 成 能 力 分 别 为 6. 48 %、7. 71 %和 7. 75 %;蛋白浓度为 0. 25 mg/mL、 0. 5 mg/mL和1 mg/mL时几乎不能达到抑制生物膜的 效果,蛋白浓度为 2 mg/mL、2. 5 mg/mL 和 3 mg/mL 时 抑制生物膜的效果较好,抑制率可达90 %以上,因此 不同的蛋白浓度对白色念珠菌生物膜形成影响较 大,蛋白浓度越高生物膜形成能力越弱,抑制率越 强;浓度为 2 mg/mL 的蛋白浓度为最佳,继而后续活 性测试都采用蛋白浓度为2 mg/mL。



3 结果与讨论

上海一恒通过上述分析得出生物膜起到屏障保护作用,使药物很难作用菌 群,因此生物膜的形成是白色念珠菌产生耐药性主 要原因之一。白色念珠菌对大部分抗真菌药物产生 多重耐药性,这些使得白色念珠菌感染对人类健康 产生更大的威胁。为了发现和开发低毒性和高治疗 活性的新型抗真菌剂,专家们试图从天然产物(植 物,动物,微生物)中寻找。例如植物来源的姜黄 素 ,厚朴酚 ,和厚朴酚 ,柠檬烯 等对白色念 珠菌生物膜的形成具有较好的抑制作用;动物来源的蛙皮抗菌肽- S1 可抑制白色念珠菌生物膜的形 成 ;微生物来源的土壤链霉菌菌株 98%乙醇提取 物 ,冠霉素链霉菌 ADP4 乙酸乙酯粗提取物 、海 洋 细 菌 枯 草 芽 孢 杆 菌 的 5 - 羟 甲 基 - 2 - 糠 醛 (5HM2F) 、粪肠球菌细菌素 EntV 等对白色念珠 菌的生物膜也具有较好的抑制效果。天然衍生的化 学抗真菌剂是一种有吸引力的选择,特别是那些微 生物衍生的分子,由于它们对机体的刺激性小,毒性 小,同时也不易使病原菌发现采取防护措施。目前 开发的大部分抗生素都源于放线菌,它被广泛认为 是新抗生素产生菌群的重要菌种,是开发价值相当 高的一类微生物。



 


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