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柞树为壳斗科栎属植物的总称，是多年生阔叶植物，主 要分布 在 我 国 东 北 和 华北地区，其中辽宁省柞树林有 182 万 hm2 ，占林地面积的 14．7%。柞树资源广泛，是一种野 外自然生长的植物，其生长环境天然无污染，柞树叶无毒无 害，目前主要作为柞蚕食用饲料而被利用。柞树叶除了含 有粗蛋白、粗脂肪、粗灰分、粗纤维、矿物质元素、维生素等营 养成分外，还富含黄酮类生物活性成分。现代药理试验已 证实，柞树叶具有清热利湿、抗炎解毒、保肝、降血糖的 作用，黄酮类化合物在发挥这些功效方面起到至关重要的作 用。
柞树叶来自蒙古栎( Quercus mongolica) ，于夏季 采自辽宁省凤城市，用清水清洗后 25 ℃ 阴干，粉碎过 60 目 筛，得柞树叶粉，于－20 ℃冰箱中保存。 芦丁标准样品购自广州市齐云生物技术有限公司，亚硝 酸钠、硝酸铝、无水乙醇、氢氧化钠等均为国产分析纯。 供试 菌 株 痢 疾 志 贺 氏 菌 ( Shigella dysenteriae， CMCC51105) 、大肠杆菌( Escherichia coli，ATCC25922) 、金黄 色葡萄球菌( Staphylococcus aureus，ATCC25923) 、肠道沙门氏 菌( Salmonella enteric，ATCC14028) ，均购自中国普通微生物 菌种保藏管理中心。
U3010 紫外/可见分光光度计( Hitachi，Japan) ; SENCO 5 L 旋转蒸发仪( 上海申生科技有限公司) ; DZF－ 6021 真空干燥箱; AL104 电子天平( METTLEＲ TOLEDO，上海) ; DHG－9070A 电热鼓风干燥箱( 上海一恒科技有限公 司) ; 98－1－B 电热套( 上海申生科技有限公司) 。
精密称取芦丁标准品5 mg， 溶解于 25 mL 的甲醇溶液中，制成终浓度为 0．2 mg /mL 的芦 丁标准溶液，备用。分别使用精密容器量取 1．0、2．0、3．0、4．0、 5．0、6．0 mL 的标准溶液，置于 25 mL 的容量瓶内，分别加水至 6 mL，混匀，随后加入 5% NaNO2 溶液 1．0 mL，充分混匀，静 置6 min 后，加入 10% Al( NO3 ) 3 溶液 1． 0 mL，混 匀，静 置 6 min，随后加入 4% NaOH 溶液 10 mL，加水定容后充分摇 匀，静置 15 min 后，以空白试剂作参比，用紫外分光光度计在 波长 510 nm 下测定吸光度，得芦丁浓度( ρ，mg /mL) 与吸光 度( A) 的回归方程，绘制标准曲线。
分别称取柞树叶粉 1．0 g，置于 50 mL 锥形瓶中，加 20 mL 50%乙醇于 60 ℃水浴 中浸提 90 min，提取物 4 层纱布过滤，5 000 r/min 的条件下 离心 20 min，收集上清液，得柞树叶总黄酮样品待测。取 1 mL待测液至 50 mL 容量瓶中，按照测定芦丁标准液吸光度 的步骤测定吸光度( A) ，重复 3 次，取平均值，计算供试品中 总黄酮的含量( 以芦丁计，mg /g) ，再计算平均值。计算公 式为: 供试样品中总黄酮含量( mg /g) = C·V·n W 式中，C 为供试品溶液的总黄酮浓度( mg /mL) ，V 为供试品 溶液定容的体积( mL) ，n 为稀释倍数，W 为称样量( g) 。
以料液比、提取时间、提取温度和 乙醇的体积分数为参考指标确定其提取的最适范围，试验重 复 3 次，计算样品中黄酮含量。
分别准 确称取 1．00 g 柞树叶粉于 250 mL 容量瓶中，在乙醇体积分 数为 50%、温度为 60 ℃、提取时间为 90 min 的条件下，控制 料液比分别为 1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50( g ∶mL) ，按“1．3．2” 方法分别提取柞树叶中总黄酮化合物并测定其含量，选择提 取适合的料液比范围。
分别 准确称取 1．00 g 柞树叶粉于 250 mL 容量瓶中，在固定乙醇 体积分数为 50%、温度 60 ℃、料液比 1 ∶20( g ∶mL) 的条件下， 将提取 时 间 分 别 控 制 在 30、60、90、120 和 150 min，按 照 “1．3．2”方法从柞树叶中提取总黄酮化合物并测定其含量，筛 查确定较佳的提取时间范围。
分别准 确称取 1．00 g 柞树叶粉于 250 mL 容量瓶中，在固定乙醇体 积分数为 50%、提取时间 90 min、料液比 1 ∶20( g ∶mL) 的条件 下，将提取温度依次控制在 40、50、60、70 和 80 ℃，依 旧 “1．3．2”方法从柞树叶中提取总黄酮化合物并测定其含量，以 便明确较佳的提取温度范围。
准确称取 1．00 g 柞树叶粉末若干份于 250 mL 容量瓶中，在固定温度 60 ℃、提取时间 90 min、料液比 1 ∶ 30( g ∶mL) 的条 件下，在乙醇体积分数分别为 10%、20%、30%、40%、50%、 60%、70%和 80%的条件下，按“1．3．2”方法从柞树叶中提取 总黄酮化合物并测定其含量，从而获得较佳的提取乙醇体积 分数范围。
根据试验方法中“1．3．1”，用紫外分光 光度计测定 510 nm 处不同浓度梯度的芦丁标准品溶液的吸 光值，以芦丁标准品的浓度( x) 作为横坐标，吸光度( y) 为纵坐标，绘制标准曲线，结果如图 1 所示。用最小二乘法经线 性回归，得回归方程: y = 13．779x－0．000 5( Ｒ2 = 0．999 5) 。结 果表明，溶液浓度控制在 8 ～ 48 μg /mL 范围内，芦丁对照品 溶液浓度与吸光度呈现良好的线性关系。
该试验中，在提取时间 90 min、提取温度 60 ℃、乙醇浓度 50%恒定不变的条件下，料液比对柞树叶总 黄酮化合物提取量的影响结果见图 2。由图 2 可见，在一定 范围内，从柞树叶中提取出的总黄酮化合物的含量随着试验 中料液比的增加而增多，这可能是由于料液比对溶剂传质过 程速度的影响，料液比越大，溶剂的传质速度越快，越有利于 黄酮类化合物的浸出; 当料液比为 1 ∶20( g ∶mL) 时，柞树 叶的总黄酮提取量最高，为( 4．97±0．06) mg /g; 而当料液比继 续增大时，总黄酮化合物的提取量反而开始下降。可见，随 着料液比的浓度增加到一定程度时，黄酮类化合物在溶剂中 的浸出会达到一种饱和的状态，致使其浸出受阻，故料液 比控制在 1 ∶20 时为最佳提取条件。
该研究针对东北地区丰富的柞树资源，为充分开发和利 用柞树叶总黄酮类化合物，选择以乙醇水溶液为溶剂，在单 因素试验的基础上，通过对料液比、提取时间、提取温度、乙 醇体积分数进行( 34 ) 正交试验，筛选出柞树叶总黄酮的最佳提取工艺为料液比 1 ∶20( g ∶mL) 、提取时间 90 min、提取温度 60 ℃、乙醇体积分数 50%。采用该优化工艺条件提取柞树 叶总黄酮，其提取量可达( 5．06±0．07) mg /g，表明利用乙醇提取柞树叶总黄酮提取工艺简单可行，没有残留，具有较好的 实际应用价值。
