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卵巢癌细胞凋亡的影响及机制研究(一恒培养箱

返回列表 来源:未知 发布日期:2019-11-05 12:07【

卵巢癌是女性最常见三大恶性肿瘤之一,5年 生存率低于50%,死 亡 率 居 妇 科 癌 症 首 位,且 近 年来卵巢癌发病率与死亡率有增长的趋势。化疗 是目前治疗卵巢癌的重要手段,然而随着药物的使 用,耐药问题 和 化 疗 毒 副 作 用 日 益 明 显,化 疗 耐 药 成为卵巢癌复发和治疗失败的主要瓶颈,寻找安 全、有效的抗肿瘤的药物势在必行。

1 材料

卵巢癌细胞株SKOV-3(华 中科技大学同济医学院附属协和医院妇产科实验室 赠 予),胎 牛 血 清 (美 国 Invitrogen Gibco 公 司)、 DMEM 高糖培养基(美国InvitrogenGibco公司),山 萘酚(Sigma公 司,纯 度>95%),AnnexinV-FITC/PI 凋亡检测试剂盒(美国BD公司),0.25%胰酶消化液、 Notch1抗体(ABclonal公司),CO2培养箱(三洋 MCO- 175型),超净工作台(苏州安泰 HT-1300型),倒置 光学显微镜(日本 OLYMPUS公司)。

2 方法

2.1 药物配置

精密称取山萘酚3.01mg,溶于5 mL二甲亚砜并依次用含10% 胎牛血清的 DMEM 高糖的细胞培养液稀释成含20,40,80μmol·L-1溶 液,备用。

2.2 卵巢癌细胞培养及分组

用含10% 胎牛血清 的 DMEM 高糖培养基体外培养卵巢癌细胞株 SK- OV-3。将SKOV-3细胞置于恒温培养箱(上海一恒LHS-50CH恒温恒湿培养箱)(5% CO2、 37 ℃)中孵育,2~3d传代一次,维持细胞处于对数 生长期。倒 置 显 微 镜 下 观 察 细 胞 形 态 变 化 情 况。 将体外培养 的 卵 巢 癌 SKOV-3细胞随机分为空白 对照 组 (0μmol·L-1 )、KA 低 剂 量 组 (20μmol· L-1)、KA 中剂 量 组(40μmol·L-1)、KA 高 剂 量 组 (80μmol·L-1)。

2.3 KA 对卵巢癌细胞增殖的影响

2.3.1 KA 对卵巢癌细胞形态的影响

取 培 养 好 的SKOV-3细胞加入12孔 培 养 板 中,于5% CO2、 37℃恒温培养箱中孵育24h,分别加入含不同质量 浓度 KA(0,20,40,80μmol·L-1)的培养液,考察不 同质量浓度(0,20,40,80μmol·L-1)KA 干预48h 后对卵巢癌细胞SKOV-3形态学的影响。

2.3.2 MTT 法 测 定 不 同 质 量

浓 度 KA 对 卵 巢 癌 细胞活 力 的 影 响 取 培 养 好 的 SKOV-3细 胞 加 入 96孔培养板中,于5% CO2、37 ℃恒 温 培 养 箱 中 孵 育24h,分 别 加 入 含 不 同 质 量 浓 度 KA(0,20,40, 80μmol·L-1)的 培 养 液,48h后 考 察 不 同 浓 度 KA 干预对卵 巢 癌 细 胞 SKOV-3 存 活 率 的 影 响。每 孔 加入 CCK-8溶 液10μL,培 养3h,酶 标 仪450nm 处测定吸光 度(A)值,计算细胞存活率。细 胞 活 力 (%)=[A(加药)-A(空 白)]/[A(0加 药)-A(空 白)]×100%。

2.4 不同质量浓度

KA 对卵巢癌 SKOV-3细胞凋 亡 的 影 响 采 用 流 式 细 胞 术,按 照 AnnexinV-FITC/PI凋亡试剂盒说明书操作,用流式细胞仪检 测不同质量 浓 度 KA(0,20,40,80μmol·L-1)干 预 48h后各组卵巢癌SKOV-3细胞的凋亡情况。

2.5 KA 对 NICD mRNA 表达的影响

将培养好 的卵巢癌 SKOV-3细 胞 接 种 在6孔 板 培 养 至 对 数 生长期,加入浓度80μmol·L-1的 KA,对照组加入 等体积的含10%胎 牛 血 清 的 DMEM 高 糖 培 养 基, 培养48h。提取 RNA:用4 ℃预冷的 PBS漂洗细 胞3次后,每孔加入1mLTrizol,吹打后移入EP管 中,冰上放置5min后,加入氯仿分 层,冰 异 丙 醇 沉 淀,无水乙醇干燥。RNA 定量后,按照试剂盒说明 书操 作,RT-PCR 反 应 条 件:95 ℃ 10s1 Cycle; 95 ℃ 5s,60 ℃ 20s,45Cycle。引物:NICD 上游 5′-GTCAACGCCGTAGATGACCT-3′,下 游 5′- TTGTTAGCCCCGTCTTCAG-3′。实验重复3次。

2.6 KA 对 Notch1蛋白表达的影响

将培养好的 卵巢癌细胞,加入80μmol·L-1的 KA,对照组加入 等体积的含10%胎 牛 血 清 的 DMEM 高 糖 培 养 液, 培养48h。按照蛋白提取试剂盒说明书提取蛋白, 并进行定量。蛋白电泳和转膜:将处理好的蛋白上 样,10% SDS-PAGE 分 离 胶 电 泳 后,电 转 移 至 PVDF膜上。免疫反应 :将膜置于5% BSA 封闭液 中封闭1h后,与多克隆兔抗人 Notch1抗体孵育, 4 ℃冰箱过夜;次日用 TBST 洗膜3次,与辣根过氧 化物酶标记的山羊抗IgG 二抗孵育1h ,用 TBST 洗膜3次。显影与凝胶成像系统分析。

2.7 统计学方法

数据采用 SPSS17.0软件进行 统计分 析,采 用 单 因 素 方 差 分 析 进 行 检 验,P< 0.05为差异有显著性。

3 结果

与 空 白 对 照 组 相 比,KA 干 预 48h后卵巢 癌 SKOV-3细胞形态发生了显著的变 化,细胞间隙增大,细胞坏死率升高,即随着山萘酚 药物浓度的增加,山萘酚对卵巢癌细胞的增殖呈显 著抑制的状态。与 空 白 对 照 组 相 比,KA 干 预 48h后卵巢 癌 SKOV-3细胞形态发生了显著的变 化,细胞间隙增大,细胞坏死率升高,即随着山萘酚 药物浓度的增加,山萘酚对卵巢癌细胞的增殖呈显 著抑制的状态。

4 讨论

近年来,由 于 天 然 化 合 物 在 防 癌、抗 癌 方 面 的 毒副作用小,其应用潜力日益受到研究者的关 注。 山萘酚是一种广泛存在于植物根、叶和果实中的黄 酮类化合物,具有多种生物学活性。现代药理研究发现山萘酚 具 有 抗 氧 化、抗 炎、抗 癌 和 预 防 心 血 管 疾病等多种 药 理 活 性,可 用 于 肿 瘤 的 预 防,发 挥 抗增殖、抗氧 化 和 致 癌 阻 断 作 用,调 节 参 与 肿 瘤 发 生发展过程的多种分子信号转导通路等。研 究发现 KA 是通过多条途径发挥抗肿瘤作用:通过 调控环氧合酶-2的转录、抑制 P-糖蛋白的功能和表 达、抑制白细胞介素-4抗细胞增殖、诱导细胞凋亡、 干预细胞信号转导和增强抑癌基因活性及抑制癌 基因表达等。



 


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