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一恒电热恒温箱在膝骨性关节炎兔软骨细胞的使

返回列表 来源:未知 发布日期:2019-09-09 10:50【

膝骨性关节炎主要是继关节软骨损伤、软骨细 胞凋亡后形成的慢性退行性病变,常伴有软骨骨化 和软骨下骨质增生。软骨细胞凋亡是膝骨性关节炎进展过程中关节软骨细胞逐渐减少的主要原因。应激活化蛋白激酶( SAPK) ,属于促分裂活 化 蛋 白 激 酶 ( mitogen - activated protein kinases, MAPKs) 家族,所主导的 JNK 信号通路在细胞增 殖、凋亡等多种生理和病理过程中起重要作用。



1 实验材料

1. 1 实验动物


5 月龄新西兰健康雄性大耳白兔 30 只,体质量( 2. 00 ± 0. 25) kg,由黑龙江省哈尔滨 市华宇养殖场提供,动物合格证号: SCXK( 黑) 2016 - 006。



1. 2 主要实验药品及试剂

玻璃酸钠注射液: 山东 博士伦福瑞达制药有限公司 生产批号: 20160409; 乌头注射液: 上海北杰集团关东药业有限公司 生产 批号: 20160401; 正清风痛宁: 湖南正清制药集团股 份有限公司,批号: 国药准字 Z43020279。L - 半胱 氨酸: Puritans Pride /普丽普莱,批号: 500872 - 03; 木瓜蛋白酶: 河北林康生物科技有限公司 批号: 2016022951; 兔抗多克隆一抗: 北 京 博 奥 森; 二 抗 PV6001、DAB 显色剂: 北京中杉金桥生物技术有限 公司; 乙醇、PBS 液、DAB 显色剂、伊红、苏木素、二 甲苯等: 均由黑龙江省中医药科学院动物实验室提 供; 其它为国产分析纯。



1. 3 实验仪器

2135 型切片机: 德国莱卡; 3000 显 微摄影成像系统: 美国 Moticam; 医用微波炉: 上海一恒电热恒温箱



2 实验方法

2. 1 实验动物分组


将 30 只雄性新西兰大耳白兔 适应性喂养 1 周后,随机分成正常组、模型组、玻璃 酸钠组、正清风痛宁组和乌头注射液组,每组 6 只。



2. 2 模型制备

除正常组外,将其他 4 组实验白兔 兔架固定,剃去右膝关节周围毛,充分暴露右膝关 节,注射戊巴比妥钠进行麻醉。消毒后将配制好的木瓜蛋白酶和 L - 半胱氨酸混合溶液按 0. 1 mL / kg 的剂量行关节腔注射,注射完毕后用灭菌棉球按压 1 ~ 2 min。造模完毕后,继续饲养 1 周。



2. 3 分组给药

以2. 2 同样的方法固定麻醉消毒 后,按 0. 1 mL / kg 的剂量分别向模型组、玻璃酸钠 组、正清风痛宁组和乌头注射液组的膝关节腔注射 生理盐水、玻璃酸钠注射液、正清风痛宁注射液和 乌头注射液,正常组不予处理。每 3 日给药 1 次,给 药 3 周。



2. 4 软骨细胞

JNK 表达的免疫组化检测 空气栓 塞法处死各组实验白兔,打开右膝关节腔,切取关 节软骨,肉眼观察关节软骨的形态,色泽等; HE 染 色后,光学显微镜下观察软骨细胞形态; 以免疫组 化法检测软骨细胞中 JNK 的表达。切片常规脱蜡 到水; 3% H2O2 中孵育 10 min,PBS 冲洗 2 min3 次; 微波修复: 切片入枸椽酸盐缓冲液( pH6) ,微波炉中 37 ℃孵育 5 min 2 次,中间间隔 10 min。自然冷却 至室温; 滴加一抗; 4 ℃冰箱中过夜,PBS 冲洗 2 min 3 次; 滴加二抗,37 ℃ 孵育 30 min,PBS 冲洗 2 min 3 次; DAB 显色 5 ~ 10 min,蒸馏水充分冲洗; 苏木素 复染 1 min; 常规脱水透明,中性树胶封片,显微镜下 观察。 Motic3000 显微摄影系统于 200 倍下摄片,采用 Image - pro plus6. 0 病理图像分析系统对阳性表达 进行定量分析,以积分光密度( IOD) 代表蛋白相对 表达量,积分光密度( IOD) = 阳性面积 × 平均光密 度。每组随机分析相同部位 6 个高倍镜视野,取其 均值代表该照片的相对表达量。染色结果细胞核 呈蓝色,阳性为黄色或黄棕色。



2. 5 统计方法

实验数据采用 SPSS19. 0 进行处 理,计量资料以( x ± s) 表示,多组间的比较采用单 因素方差分析( one - way ANOVA) ,P < 0. 05 表示有 统计学意义。



3 实验结果

见图 1,表 1。




4 讨论


膝骨性关节炎的病理学变化主要是细胞外基 质的降解过度、软骨成分丢失、软骨结构和功能被破坏。这是一系列炎性因子、生长因子等与软骨细 胞膜受体特异性结合,软骨细胞内 JNK 信号转导通 路被激活,最终引起金属蛋白酶( MMPs) 的高表达、软骨细 胞 凋 亡、细胞外基质降解加剧的过程。 JNK 信号通路的模式可大致总结为: 静止细胞质中 的 JNK→应激→JNK 活化转位细胞核→磷酸化核内 转录→靶基因的转录和新蛋白质合成→相应的生 物学效应。



 


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