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上海一恒摇床使用于细胞中转运特性的研究

返回列表 来源:未知 发布日期:2019-08-30 15:02【

芹菜素(apigenin)又称芹黄素,化学名为4′,5, 7-三羟基黄 酮(4′,5,7-trihydroxyflavone),是 芹 菜 中黄酮类化合物的主要成分,也是其发挥生理功效 的主要活性物质。芹菜素在高亲水性和非极性溶 剂中的溶解性差,几乎不溶于水,可溶于热乙醇、二 甲基亚砜(DMSO)和稀 KOH 溶液。目前对芹菜 素的研究主要集中在提取工艺、检测方法及药理作 用等方面。



1 材料与方法

1.1 仪器


Angilent1220LC型高效液相色谱仪(美 国 Aglient公司),XS105型电子天平(德国梅特勒-托 利多公司),TDL-40B型高速冷冻离心机(上海安亭科 学仪 器 厂),超 净 工 作 台(苏 州 净 化 设 备 总 厂),CO- 150型二氧化碳孵箱(美国 NBS公司),THZ-100型 恒温摇床(上海一恒科学仪器有限公司),MX6R 型 倒置 显 微 镜 (宁 波 舜 宇 仪 器 有 限 公 司),Millicell- ERS型电位 仪(美 国 Millipore公 司),pHS-3 型 精 密pH 计(上 海 精 科 雷 磁 仪 器 厂),SpectraMax190 型酶标仪(美国 MolecularDevices公司)。



1.2 试 药

芹 菜 素 对 照 品(上 海 谷 研 实 业 有 限 公 司,批号:150623,纯 度≥98%),DMEM 培 养 基(美 国 Hyclone公 司,批 号 11995-065),非 必 需 氨 基 酸 (美国 Hyclone公司,批号SH30238.01),青霉素-链 霉素双抗 液(美 国 Hyclone公 司,批 号 SV30010), 胰蛋 白 酶 (美 国 Hyclone 公 司,批 号 25200056), Hank's平衡 盐 溶 液(HBSS,美 国 Hyclone公 司,批 号SH30016.07),PBS缓冲液(美 国 Hyclone公 司, 批号SH30256.01B),ExCell胎 牛 血 清 (澳 大 利 亚 ExCell公司,批号 FND500),维拉帕米(中国食品药 品检定研究院,批号100223-200102),环孢菌素 A (中国食品药品检定研究院,批号130495-201303), 二甲基亚砜(DMSO 分析纯,美国Sigma公司,批号 WXBB7100V),甲醇、乙腈(色谱纯,美国FisherSci- entific公司),超纯水(实验室自制)。



1.3 细胞株

Caco-2细胞株传代数在20~40代内 (武汉博士德生物工程有限公司,批号 CX0064)。



1.4 Caco-2细胞模型的建立与评价方法

将 Caco-2细 胞 培 养 于 10% DMEM 高 糖 培 养 液 (含 10% FBS,1%青霉素-链霉素,1%非必需氨基酸等) 中,在5% CO2,37℃培养箱中培养至细胞对数生长期后用胰酶 消 化,10% DMEM 混 悬 后 调 整 细 胞 密 度为2×105 个/mL,接种 于 Transwell12孔 板(聚 碳酯膜将每孔分为上下 两 侧 室,上 侧 室 AP 侧 是 肠 腔侧,下侧室 BL侧是基底侧)培养,连续培养21d, 测 量 跨 膜 电 阻 值 (transepithelial electrical resistancevalues,TEER)。



1.5 芹菜素安全浓度范围的确定

采用 MTT 法,将 Caco-2细胞以每 孔5×104 个/mL 的 细 胞 密 度接种 于 96 孔 板,5% CO2、37℃ 条 件 培 养 24h。 对照组(细胞加入200μL10%的 DMEM 高糖培养 液),实验组(HBSS溶液稀释制备芹菜素系列浓度工 作 液:0.50、5.00、15.00、25.00、50.00、100.00、200.00、 400.00μg/mL,每 个 浓 度 设 置6个 复 孔,各 实 验 组 细胞分别加入不同浓度芹菜素工作液200μL),空 白组(作调零孔,培养基,孵 育24h后,各 组 细 胞 分 别加入5mg/mL的 MTT 试剂20μL,孵育4h后, 弃去溶液,再加入150μLDMSO 溶解残留的 MTT 甲臜 结 晶,震 荡 混 匀,测 定 570nm 处 的 吸 光 度 (OD)值,计算细胞存活率,细 胞 存 活 率=(OD实 验 组 -OD空 白 组 )/(OD对 照 组 -OD空 白 组 )。



1.6 芹菜素在 Caco-2细胞中的转运实验方法

取 Caco-2细胞单 层 模 型 用 HBSS缓 冲 液(37℃)荡 洗3次,加入 HBSS缓 冲 液,孵 育20 min,弃 上 清, 立即开始双向转运试验。考察顶侧(AP侧)→基底 侧(BL侧)转运,在 AP侧分别加入0.5mL含药PBS 液,作为供试液,BL侧加入空白PBS液1.5mL,置恒 温摇床(37℃,40r/min)中 孵 育,于 15、30、45、60、 90、120、150、180min时从 BL 侧吸取200μL 溶液 作为供试品,同 时 补 加200μL 空 白 PBS液。考 察 BL侧→AP侧转运时,在 BL侧分别加入1.5mL含 不同浓度不同药物的 PBS液 作 为 供 试 液,AP 侧 加 入空 白 PBS 溶 液 0.5 mL,置 于 恒 温 摇 床 (37℃, 40r/min)中 孵 育,分 别 在 15、30、45、60、90、120、 150、180min时从 AP侧吸取200μL溶液作为供试 品,同时补加200μL 空 白 PBS液。吸 取 的 供 试 品 均按已建立方法进行前处理,采用 HPLC法测定含 量,计算表观渗透系数Papp,Papp=dQ/dt×A×C0, 式中dQ 为dt内的转运量,A 为12孔板表膜面积, C0 为供给室的初始质量浓度),外排比值 RB-A/A-B= (Papp(A-B/B-A)/Papp(B-A/A-B))。



2 结果

Caco-2细胞单层细 胞 TEER值>500Ω/cm2,检测标志物荧光素钠通 透性的表观渗透系数 Papp =(8.27±1.31)×10-7 cm/s,当 TEER>300Ω/cm2,Papp<10-6cm/s,表明 单层细胞的紧密性和完整性良好,建立的 Caco-2细 胞模型符合细胞转运实验的要求。当 芹 菜 素 浓 度 < 200.00μg/mL时,Caco-2细 胞 存 活 率 均>85%,确 定芹菜素安全浓度范围为200.00μg/mL 以 内,进 行双向转运。随着孵 育 时 间 的 增 加,高、中、低浓度芹菜素在 Caco-2细胞中双 向 转 运 的 Qr值 均 增 加,其 中 中 浓 度芹菜素双向转运的 Qr值高于高、低浓度,差异有 统计学意义 (P <0.05)。芹菜素双侧Papp值均随着 浓度的增加而减少,不同浓度间Papp值的比较,差异 有统计学意义 (P <0.01)。高、中浓度芹菜素 AP- BL侧Papp值高于BL-AP侧,差异有统计学意义 (P <0.05)。高、中、低 浓 度 芹 菜 素 的 RB-A/A-B值 均 < 1.5,见表1。



3 讨论


Caco-2细胞来源于人的结肠癌细胞,其结构特 性和生化作用类似于小肠上皮细胞,可作为研究药 物体外肠吸收机制及相互作用的分子筛选工具,同 源性较好。以 细 胞 毒 性 试 验 MTT 比 色 法 检 测 Caco-2细胞的存活和生长,琥珀酸脱氢酶存在于受 损伤的活细胞 线 粒 体 中,能 还 原 外 源 性 的 MTT 成 蓝紫色结 晶 甲 瓒(Formazan),死 细 胞 无 此 功 能,该 法操作简便、重复性好。药物在小肠的吸收情况 可用 Caco-2单层细胞模型的表观渗透系数 Papp值 评价,通常人体吸收较完全的药物Papp>10-4cm/s, 而吸收差的药物(吸收<1%)的Papp<10-7cm/s。 在 Caco-2细胞 中 通 常 用 Papp(AP-BL)与 Papp(BL- AP)的比值表示外排比率 RB-A/A-B,其可作为评价药 物转运特性的指标。如果药物主要被小肠顶侧膜的 转运载体所摄取,AP侧到 BL侧的 Papp值应明显大 于 BL侧到 AP侧 的 Papp值,则 RB-A/A-B值<1;如 果 药物转运主要以被动扩散形式完成,AP侧到 BL侧 的Papp值 与 BL 侧 到 AP 侧 的 Papp 值 应 该 相 当, RB-A/A-B值接近于1;如 果 药 物 被 小 肠 顶 侧 膜 的 转 运 蛋白分泌或 外 排,存 在 主 动 转 运 机 制,转 运 有 方 向 性,BL 侧 到 AP 侧 的 Papp值 会 远 远 大 于 AP 侧 到 BL侧 的 Papp值,则 RB-A/A-B值>1.5。



 


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