地龙酶解液纯化工艺研究（一恒BPH-9082使用）

地 龙 为 巨 蚓 科 动 物 参 环 毛 蚓Pheretima aspergillum（E. Perrier）、通 俗 环 毛 蚓Pheretima vulgaris Chen、 威 廉 环 毛 蚓Pheretima guillelmi （Michaelsen）或 栉 盲 环 毛 蚓Pheretima pectinifera Michaelsen 的干燥体。前一种习称“广地龙”，后三 种习称“沪地龙”。具有清热定惊、通络、平喘、利 尿的功效。用于高热神昏，惊痫抽搐，关节痹痛，肢 体麻木，半身不遂，肺热喘咳，尿少水肿，高血压等病症。

1 实验仪器与试剂

1.1 实验仪器

一恒BPH-9082型精密恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司），HH-601 超级恒温水浴锅（镇江瑞 祥仪器有限公司），MS104 型十万分之一天平、MS1 05DU 万分之一天平（梅特勒 - 托利多国际贸易上 海有限公司），KQ2200DV 型超声振荡仪（杭州法兰 特超声波科技有限公司，DKH-43 型实验室用膜处 理设备（上海陶氏膜处理集团），LG1100 型蠕动泵 （dragonlab 仪器公司），1000Da 纳滤膜，3000Da 超滤 膜，烧杯（规格：10 mL、100 mL、1000 mL、5000 mL）， 量筒（规格：10 mL、100 mL），培养皿（直径 10 cm）， 玻璃棒。

1.2 试剂

凝 血 酶（批 号：20150610，活 力：500 U/g，深 圳 生 化 制 剂 厂）；试 管（0.5 cm×10 cm）；培 养 皿（直 径 10 cm）；琼 脂 糖（批 号：20151102，国 药 集 团 化 学试剂有限公司）；牛血纤维蛋白原（纯度 95.3%， 批 号：20140103，购 自 沈 阳 拜 英 生 物 科 技 有 限 公 司）；牛 血 清 白 蛋 白 BSA（纯 度：99.9%，购 自 国 药 集团化学试剂有限公司）；注射用尿激酶（活性：30 万 U/g，辽宁天正生物制药有限公司）；生理盐水（500 mL，山 东 华 鲁 制 药 集 团）；DA201-C、D101、 AB-8 大孔吸附树脂（购自沧州宝恩树脂有限公司）； sephadex G15、sephadex G25、sephadex G50、Agilent BOZAX300SB-C18肽 色 谱 柱（150 mm，5 μm）、C18 半制备色谱柱（250 mm×50 mm，10 μm），以上色 谱柱购自济南华哲实验仪器有限公司；TSK-GEL G2000SWXL 凝 胶 色 谱 柱（300 mm，5 μm，125A）， RP-kromasiloC18色谱柱，以上色谱柱购自日本 TSK 公司；分子量测定标准物质（BSA66430、血管紧张 素 1045.5、低分子肝素钠 3700、乙酰胺乙酰胺乙酸 189.1）购自上海源叶生物科技有限公司。

2 实验方法与结果

2.1 纤维平板纤溶实验试剂配制

磷酸（PBS）缓冲溶液制备：称取磷 酸氢二钠和磷酸二氢钠适量，加入适量去离子水，制 成 pH=7.2 的磷酸缓冲溶液。 工作液：将生理盐水和配好的 PBS 溶液按照 17∶1 的比例配制工作液。 牛纤维蛋白原溶液：取 0.3 g 牛纤维蛋白原，加 工作液 100 mL 溶液。配制成 0.3% 的牛纤维蛋白原 溶液。 凝血酶溶液：取凝血酶 1.0 g，加生理盐水制成 10 U/mL 溶液。 标准曲线建立：取工作液 100 mL，采用电热套 对其加热煮沸，加入 0.5 g 琼脂糖，待其彻底溶解后， 取出、放凉至 50 ℃，加入 20 mL 牛纤维蛋白原溶液， 加入 1.0 mL 10 U/mL 凝血酶溶液，振荡后导入培 养皿内部，每个培养皿 10 mL，放入 4 ℃冰箱冷藏 15 min。用直径为 1 mm 打孔器进行打孔，并在每个 孔内加入“2.1.1”项下各尿激酶标准溶液 10 μL，放 入恒温培养箱培养 12 h（37 ℃）。取出后采用游标 卡尺对溶圈进行测定，计算溶圈面积。以溶圈面积 为纵坐标，以尿激酶活力（U）的对数为横坐标进行 线性回归，得出实验结果如图 1。 实验结果表明：线性方程为 Y=1.564X-1.8635， R2 =0.9972，线性良好。

2.2 多肽标准曲线对照品溶液

精密称取牛血清白蛋白 10 mg，加 去离子水溶解，而后转移至 50 mL 容量瓶中定容，备 用。 碱 性 铜 试 液 配 制：精 密 称 取 烘 干 后 的 NaOH10.0 g、Na2CO3 50 g，加水 400 mL 溶液，备用， 作 为 A 液；再 取 酒 石 酸 钾 钠 0.5 g、五 水 硫 酸 铜 0.25 g，加水 80 mL 溶解，作为 B 液。使用时 A 液、B液混合定容至 500 mL 即得碱性铜试液。

福林酚试液配制：取乌酸钠（Na2WO4·2H2O） 50 g、钼酸钠 12.5 g，加水 500 mL 置于 2000 mL 圆底 烧瓶内，再加入 35% 磷酸溶液 25 mL、盐酸（质量分 数为 38.5%）50 mL，然后至于加热套内冷水回流加 热，沸腾后计时，保持微沸 10 h，再加硫酸锂 25 g、去 离子水 50 mL，摇匀，然后加 0.2 mL 溴，敞口加热挥 发多余的溴，保持沸腾 15 min，放凉，倒出，过滤，置 于棕色容量瓶内，然后定容至 500 mL，备用。 精 密 量 取 对 照 品 溶 液 0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、 1.0 mL，分别置具塞试管中，各加水至 1.0 mL，再分 别加入碱性铜试液 1.0 mL，摇匀，各加入福林酚试 液 [ 取福林试液储备液（1 → 16）]4.0 mL，立即混匀， 置 55 ℃水浴中反应 5 min，取出，置冷水浴中冷却 10 min，照紫外 - 可见分光光度法 (《中华人民共和 国药典》2015 年版一部附录Ⅴ A)，以 0 号管为空白， 在 650 nm 波长处迅速测定吸光度。以吸光度为纵 坐标，牛血清白蛋白含量为横坐标，绘制标准曲线， 并计算线性回归方程，结果如图 2。

3 结论

采用 DA201-C 树脂对地龙酶解液进行 吸附工艺考察，通过静态吸附和动态吸附工艺考 察，得出最佳吸附条件。并进行验证得出采用最佳 吸附条件进行实验，地龙活性肽吸附率可以达到 89.65%。 大孔树脂对物质吸附原理为范德华力，利用 物质间极性差异和在不同溶剂的溶解度进行分离。 多肽由氨基酸组成，氨基酸由于侧链基团不同极性 具有差异，因此不同氨基酸组成的多肽之间极性差 异明显，正是利用此特点本实验结合大孔树脂对物 质的吸附原理结合多肽特点进行实验，为后期多肽类物质的纯化研究做好基础。



 

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