微生物检查方法研究(一恒LRH-250B)使用

蜂蜜是天然的防腐剂、黏合剂，具有较高营养 价值和功效。明代李时珍《本草纲目》云:“蜂蜜，其 入药之功有五: 清热也，补中也，解毒也，润燥也，止痛 也”。其作为中药辅料使用在我国历史悠久。本研究中 参照 2015 年版《中国药典( 四部) 》非无菌产品微生物限 度检查法，用 5 种微生物代表菌株，加入不同含糖 浓度的蜂蜜中，采用平皿法试验，确定其抑菌性与含糖 浓度的关系。

1 仪器与材料

1．1 仪器

HFsafe － 1200 LC 型生物安全柜( 上海力申科学仪 器有限公司) ; BS2202S 型电子分析天平( 德国赛多利斯 公司) ; SHA － C 型水浴恒温振荡器( 天津鑫博得仪器有 限公司) ;一恒LRH-250B型生化培养箱( 上海一恒科学仪 器 有 限 公 司) ; 霉 菌 培 养 箱( 重庆四达实验仪器厂) ;VITEK2 型全自动微生物鉴定系统( 法国梅里埃有限公 司) ; CH 型三目显微镜( 日本奥林巴斯公司) 。

1．2 菌种

金黄色葡萄球菌[CMCC( B) 26003 ]、铜绿假单胞菌 [CMCC( B) 10104 ]、枯草芽孢杆菌[CMCC( B) 63501 ]、白 色念珠菌[CMCC( F) 98001]和黑曲霉[CMCC( F) 98003]均 源于中国医学细菌保藏管理中心，工作用菌株为第 2 代。

1．3 培养基

胰酪大豆胨琼脂培养基( TSA，批号为 170325) ，沙 氏葡萄糖琼脂培养基( SDA，批号为 170316) ，胰酪大豆 胨液体培养基( TSB，批号为 170329) ，沙氏葡萄糖液体 培养基( SDB，批号为 160316) ，均购自北京陆桥技术有 限责任公司。

1．4 供试品

槐花蜜( 批号为 20171108，玻璃瓶装，陕西春秋食品有限公司) ; 枣花蜜( 批号为 20171206，玻璃瓶装，陕 西秦岭蜂业有限公司 ) ; 秦 岭 紫 椴 雪 蜜 ( 批 号 为 20180428，玻璃瓶装，陕西春秋食品有限公司) 。

2 方法与结果

2．1 试验菌种鉴定

按照 VITEK2 型全自动微生物鉴定系统操作规范， 将 5 种试验菌株分别进行增菌、分离、纯化，并进行革兰 染色、镜检。以无菌方式挑取分纯菌落置 3 mL 0． 45% NaCl 试管中，采用比浊仪调整菌液浓度至规定菌悬液 浓度。根据各个菌株革兰染色结果选定相应鉴定卡片， 按顺序放在载卡架上，输样管插入菌液管中。将载卡架 放入仪器的填充仓，关闭仓门，进行鉴定培养。结果显 示，均检出标准菌株。

2．2 试验菌液制备

将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌 分别接种于 TSB 中，35 ℃培养 24 h; 将白色念珠菌接种 于 SDB 中，25 ℃培养 3 d; 将黑曲霉接种于 SDA 中，25 ℃ 培养 7 d，加入 5 mL 含 0． 05% 聚山梨酯 80 的 0． 9% 氯 化钠溶液，洗脱孢子，收集孢子悬液，用含 0． 05% 聚山 梨酯 80 的 0． 9% 氯化钠溶液制成适宜浓度的孢子悬 液。采用 10 倍稀释法将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞 菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉分别稀释至含 菌量为 104 cfu / mL 的试验菌液。

2．3 培养基适用性检查

取不大于 100 cfu 的标准菌株金黄色葡萄球菌、铜 绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉，分别 接入测试与对照培养基，经规定温度、时间培养，测试结 果与对照培养基平均菌落数的比值应为 0． 5 ～ 2． 0，且 菌落形态、大小应与对照培养基上的菌落一致; 被检液体培养基管与对照培养基管比较，试验菌生长良好。培 养基适用性检查符合 2015 年版《中国药典( 四部) 》附录 检查方法。

2．4 平皿法验证试验

供试液制备: 取 3 个品种的蜂蜜( 槐花蜜、枣花蜜、 椴树蜜) 各 15，25，40，55，70，80 mL，分别加 TSB 至 100 mL。 45 ℃ 恒温振摇 15 min 使其溶解均匀，制成 6 种含糖浓 度分别为 11． 25%，18． 75%，30． 00%，41． 25%，52． 50% ， 60． 00% 的供试液。 试验组溶液制备: 取 3 个品种蜂蜜的 6 种不同含糖 浓度的供试液，各分装于 5 个无菌试管中，每管装量为 9． 9 mL，再分别加入含菌量不大于 104 cfu / mL 的金黄 色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠 菌、黑曲霉 5 种试验菌液各 0． 1 mL。 菌液对照组制备: 将 TSB 分装于 5 个无菌试管中， 每管装量为 9． 9 mL，同试验组操作，分别加入含菌量不大于 104 cfu / mL 的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯 草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉试验菌液各 0． 1 mL。 供试品对照组制备: 取供试液 9． 9 mL，加入 TSB 0． 1 mL。 回收率试验: 分别取上述试验组、菌液对照组和供 试品对照组溶液各 1 mL，置直径为 90 mm 的培养皿中， 注入 TSA 或 SDA，混匀，凝固，TSA 平板在 35 ℃培养 3 d， SDA 平板在 25 ℃ 培养 5 d，计数。供试品 5 种试验菌的 回收率均需进行 3 次重复试验，若供试品 5 种试验菌的 回收率均为 0． 5 ～ 2． 0，供试品的需氧菌总数、霉菌和酵 母菌总数计数方法适用性试验通过。供试品回收率( % ) = ( 试验组菌落数 － 供试品对照组菌落数) /菌液对照组 菌落数。

2．5 回收率曲线图

需氧菌总数回收率详见图 1，霉菌、酵母菌总数。可见，3 种不同蜂蜜随着含糖浓度( 含糖 分数) 的升高对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽 孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉均有不同程度的抑制作 用，槐花蜜和椴树蜜在含糖浓度大于 40% 时对金黄色 葡萄球菌、铜绿假单胞菌和白色念珠菌回收率试验呈显 著下降趋势。而枣花蜜在含糖浓度 30% 以上时金黄色 葡萄球菌、铜绿假单胞菌和白色念珠菌的回收率便呈下 降趋势。3 种蜂蜜对枯草芽孢杆菌和黑曲霉的抑制作用 不明显，均为 0． 5 ～ 2． 0，符合 2015 年版《中国药典》要 求。3 种不同蜂蜜对白色念珠菌有较明显的抑制作用，槐花蜜和椴树蜜在含糖浓度 40% 以上时回收率呈下降 趋势，枣花蜜在含糖浓度 30% 以上时回收率呈下降趋势。 3 种蜂蜜对黑曲霉的抑制作用不明显，均为 0． 5 ～ 2． 0。 与需氧菌总数回收率试验中的白色念珠菌与黑曲霉的 回收率测定结果一致。

3 讨论

采用平皿法对 6 个不同含糖浓度的 3 种蜂蜜进行 需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数回收率测定，试验结果 说明，随着蜂蜜含糖浓度( 含糖分数) 的增加，各组试验菌回收率均呈降低趋势。含糖浓度高的蜂蜜对金黄色 葡 萄球 菌、铜 绿假 单胞 菌、白 色念 珠菌、酵母 菌 均有 较强抑制作用，而对枯草芽孢杆菌和黑曲霉的抑制作 用相对较弱。



 

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