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黑骨藤总黄酮工艺研究(一恒干燥箱使用)

返回列表 来源:未知 发布日期:2019-11-20 11:36【

黑骨藤(Periploca forrestii Schltr)有祛风除湿、活血通络、 消痹止痛的功效,主要分布在我国西南、青海、西藏等地, 含有强心苷类、C21 甾类、多糖类、黄酮类和三萜皂苷类成分, 其抗炎作用与黄酮、皂苷以及多糖相关 。目前对黑骨藤中黄酮的研究主要注重含量的测定,鲜有黄酮提取及纯化工艺 的报道。本研究比较了不同大孔树脂分离纯化黑骨藤总黄酮的 工艺,通过优化纯化工艺条件,为黑骨藤总黄酮开发提供实 验依据。

1 材料与方法

1.1 实验药物

黑骨藤采集自贵阳花溪,经鉴定为萝摩科杠 柳属植物黑骨藤的藤茎;芦丁对照品(中国药品生物制品检定 所,批号 160212)

1.2 主要试剂与仪器

X-5、D101、NKA-9、AB-8、S-8 及 HPD100 大孔树脂均购自沧州宝恩化工有限公司;其余试剂均 为分析纯。R-220 旋转蒸发仪购自上海亚荣生化仪器厂;双光 束紫外可见分光光度计购自上海谱元仪器有限公司;AE240 型电子天平购自瑞士梅特勒 - 托利多公司;真空干燥箱购自 上海一恒实验仪器总厂。

1.3 黑骨藤总黄酮的提取

依据预实验,取黑骨藤干燥、粉 碎,过 40 目,准确称取粉末 2 g,加 20 倍量的 75%乙醇, 80 ℃水浴回流提取 2 h,提取 3 次,合并滤过液,减压浓缩至 无乙醇味,少量离子水溶解,备用。

1.4 黑骨藤总黄酮含量的测定

采用 NaNO2-Al(NO)3-NaOH 法,以芦丁为对照,于波长 510 nm 测定吸光度值,以吸光度 为纵坐标,芦丁质量浓度为横坐标,得回归方程为 Y = 9.876X-0.006 1,r = 0.999 8。

1.5 大孔吸附树脂的选择

称取 X-5,D101,NKA-9,AB-8, S-8,HPD100 大孔吸附树脂适量,乙醇浸泡 24 h,回流提取 12 h。湿法装柱,95%乙醇洗至无白色浑浊,改用去离子水洗 涤至无醇味。5%HCl 冲洗后用去离子水洗至中性,再用 2% NaOH 冲洗后用去离子水洗至中性,备用。选取 2 g 树脂置于 100 mL 三角瓶中,加入 50 mL 浓度(C0)为 1.327 mg/mL 的供试 液,30 ℃条件下 90 r/min 吸附 24 h 后,检测上清总黄酮浓 度(C1)。静置,弃去上清液,去离子水洗涤,再用 75%乙醇 50 mL,同样条件下解吸 24 h,检测解析液总黄酮浓度(C2)。其 中静态吸附量 Q(mg/g)=(C0-C1)×V/M,吸附率(%)=(C0-C1)/C0。 静态解析率(%)=(C2×V)×100%/(M×Q)。

1.6 提取纯化工艺的考察

①上样液浓度的确定:本试验考 查了树脂体积为 25 mL,浓度分别为 5.250、2.625、1.308、 0.654、0.327、0.164 mg/mL 上样液对树脂吸附率的影响。
②上 样流速的确定:本试验考查了树脂体积为 25 mL,流速分别为 1、2、3、4、5 BV/h 对吸附率的影响。
③上样液的 pH 值的确 定:本试验考查了树脂体积为 25 mL,pH 为 1.26、2.52、 3.24、4.55、5.63、6.48 对树脂吸附率的影响。
④上样液体积 的确定:量取 25 mL 树脂湿法装柱,选取浓度为 1.308 mg/mL 黑骨藤总黄酮,每 10 mL 收集 1 管,黄酮泄漏明显时收集的液 体总体积即为上样液体积。
⑤洗脱液浓度的确定:吸附饱和的 大孔树脂分别采用 15%、30%、45%、60%、75%、90%、 95%乙醇依次洗脱,收集洗脱液。
⑥洗脱体积的确定:吸附饱 和的大孔树脂,采用去离子水洗脱至无色,然后改用 75%乙 醇洗脱,每 10 mL 收集 1 管,测定并计算解析率。
⑦洗脱剂流 速的确定:吸附饱和的大孔树脂,用去离子水洗脱至无色,用 75%乙醇洗脱,流速分别控制在 l、2、3、4 BV/h。1.7 中试工艺的验证 在上述研究的基础上,进行了 3 次中 试验证。

1.8 统计学方法

采用 SPSS19.0 统计学软件进行数据分析, 数据资料用(x±s)表示,进行单因素方差分析,组间比较用 Duncan 检验,以 P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 6 种大孔树脂静态吸附及解析结果

见表 1。AB-8 树脂 的吸附量明显高于 NKA-9 和 S-8 树脂,吸附率明显高于 X-5、 D101、NKA-9、S-8 树脂,而解析率明显高于 X-5、D101、 NKA-9、S-8、HPD100 树脂,差异均有统计学意义(P<0.05), 故选择 AB-8 为最佳树脂。


2.2 提取纯化工艺考察结果

①上样液浓度结果 当 浓度为 0.164 mg/mL、0.327 mg/mL 时,树脂吸附量较高,但浓 度过低将增加上样时间。当浓度超过 1.308 mg/mL 后,吸附量 明显下降。故选定上样液浓度为 1.308 mg/mL。1~3 BV/h 吸附率下降平缓,而 3~5 BV/h 吸附率 下降显著,但流速过慢将延长吸附时间。因此,选择流速控制 在 3 BV/h。③上样液的 当上样液的 pH 值为 1.26、2.52 及 3.24 时吸附率较大,伴随 pH 的增加,吸附 率呈现下降趋势,但 pH 过低,黄酮苷易水解,部分还会形成 烊盐。因此,选择 pH 为 3.24。④上样液体积考察结果。 黄酮从 50 mL 及 2 BV 开始泄漏,>2 BV 时,泄漏明显,3 BV 及 75 mL 达到饱和,因此,上柱体积为 2 BV 最合适。⑤洗脱 随着洗脱剂浓度的增加,解析率也在 增加,当浓度 75%时,解吸率最高。因此洗脱剂浓度定为 75%。⑥洗脱液体积考察结果。伴随洗脱体积的增加, 解析液黄酮的浓度也在增加,当洗脱体积为 4 BV 时,洗脱液 中的黄酮含量很少。因此洗脱体积选择 4 BV。⑦洗脱剂流速 伴随流速的增加,解析率明显降低。但流速过低,洗脱时间将延长。因此,洗脱流速控制在 2 BV/h。

2.3 中试工艺验证结果

通过对 75%乙醇洗脱液黄 酮含量的测定,结果总黄酮的含量为 70.31%。RSD 为 1.48%, 表明本实验所建立的 AB-8 大孔树脂法分离纯化黑骨藤总黄酮 的方法稳定、可靠。

3 讨论

黑骨藤的抗炎疗效与其所含的黄酮存在一定关系,但有 关黑骨藤黄酮的报道较少。郭江涛等采用紫外可见分光光度 法测定了黑骨藤中总黄酮的水平,方法快速简便,结果可靠, 可以用于测定黑骨藤中总黄酮的水平。景小楠等也采用同样 的方法分析了黑骨藤中总黄酮含量,方法基本类似。冉启军 等研究了黑骨藤中总黄酮抗炎镇痛作用,通过小鼠热板法镇 痛试验及冰醋酸致小鼠扭体反应模型显示黑骨藤总黄酮具有 较好的抗炎消肿与镇痛作用,可作为黑骨藤药材的指标性成 份。然目前针对黑骨藤黄酮提取及纯化工艺的报道较少,因 此,黑骨藤黄酮分离纯化工艺的研究具有一定的价值,可以 为黑骨藤总黄酮的开发提供依据。



 


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