一恒

服务热线:021-58201756
13621695486

他们都在找: 一恒BPC-70F生化培养箱(液 一恒DHP-9162台式电热微生物
当前位置主页 > 新闻动态 > 行业动态 >

地龙酶解液纯化工艺研究(一恒BPH-9082使用)

导读:采用3种大孔树脂对地龙酶解液进行纯化,筛选出最佳纯化树脂,并建立最佳纯化方法。


返回列表 来源:未知 发布日期:2019-11-13 11:20【

地 龙 为 巨 蚓 科 动 物 参 环 毛 蚓Pheretima aspergillum(E. Perrier)、通 俗 环 毛 蚓Pheretima vulgaris Chen、 威 廉 环 毛 蚓Pheretima guillelmi (Michaelsen)或 栉 盲 环 毛 蚓Pheretima pectinifera Michaelsen 的干燥体。前一种习称“广地龙”,后三 种习称“沪地龙”。具有清热定惊、通络、平喘、利 尿的功效。用于高热神昏,惊痫抽搐,关节痹痛,肢 体麻木,半身不遂,肺热喘咳,尿少水肿,高血压等病症。

1 实验仪器与试剂

1.1 实验仪器

一恒BPH-9082型精密恒温培养箱(上海一恒科学仪器有限公司),HH-601 超级恒温水浴锅(镇江瑞 祥仪器有限公司),MS104 型十万分之一天平、MS1 05DU 万分之一天平(梅特勒 - 托利多国际贸易上 海有限公司),KQ2200DV 型超声振荡仪(杭州法兰 特超声波科技有限公司,DKH-43 型实验室用膜处 理设备(上海陶氏膜处理集团),LG1100 型蠕动泵 (dragonlab 仪器公司),1000Da 纳滤膜,3000Da 超滤 膜,烧杯(规格:10 mL、100 mL、1000 mL、5000 mL), 量筒(规格:10 mL、100 mL),培养皿(直径 10 cm), 玻璃棒。

1.2 试剂

凝 血 酶(批 号:20150610,活 力:500 U/g,深 圳 生 化 制 剂 厂);试 管(0.5 cm×10 cm);培 养 皿(直 径 10 cm);琼 脂 糖(批 号:20151102,国 药 集 团 化 学试剂有限公司);牛血纤维蛋白原(纯度 95.3%, 批 号:20140103,购 自 沈 阳 拜 英 生 物 科 技 有 限 公 司);牛 血 清 白 蛋 白 BSA(纯 度:99.9%,购 自 国 药 集团化学试剂有限公司);注射用尿激酶(活性:30 万 U/g,辽宁天正生物制药有限公司);生理盐水(500 mL,山 东 华 鲁 制 药 集 团);DA201-C、D101、 AB-8 大孔吸附树脂(购自沧州宝恩树脂有限公司); sephadex G15、sephadex G25、sephadex G50、Agilent BOZAX300SB-C18肽 色 谱 柱(150 mm,5 μm)、C18 半制备色谱柱(250 mm×50 mm,10 μm),以上色 谱柱购自济南华哲实验仪器有限公司;TSK-GEL G2000SWXL 凝 胶 色 谱 柱(300 mm,5 μm,125A), RP-kromasiloC18色谱柱,以上色谱柱购自日本 TSK 公司;分子量测定标准物质(BSA66430、血管紧张 素 1045.5、低分子肝素钠 3700、乙酰胺乙酰胺乙酸 189.1)购自上海源叶生物科技有限公司。

2 实验方法与结果

2.1 纤维平板纤溶实验试剂配制

磷酸(PBS)缓冲溶液制备:称取磷 酸氢二钠和磷酸二氢钠适量,加入适量去离子水,制 成 pH=7.2 的磷酸缓冲溶液。 工作液:将生理盐水和配好的 PBS 溶液按照 17∶1 的比例配制工作液。 牛纤维蛋白原溶液:取 0.3 g 牛纤维蛋白原,加 工作液 100 mL 溶液。配制成 0.3% 的牛纤维蛋白原 溶液。 凝血酶溶液:取凝血酶 1.0 g,加生理盐水制成 10 U/mL 溶液。 标准曲线建立:取工作液 100 mL,采用电热套 对其加热煮沸,加入 0.5 g 琼脂糖,待其彻底溶解后, 取出、放凉至 50 ℃,加入 20 mL 牛纤维蛋白原溶液, 加入 1.0 mL 10 U/mL 凝血酶溶液,振荡后导入培 养皿内部,每个培养皿 10 mL,放入 4 ℃冰箱冷藏 15 min。用直径为 1 mm 打孔器进行打孔,并在每个 孔内加入“2.1.1”项下各尿激酶标准溶液 10 μL,放 入恒温培养箱培养 12 h(37 ℃)。取出后采用游标 卡尺对溶圈进行测定,计算溶圈面积。以溶圈面积 为纵坐标,以尿激酶活力(U)的对数为横坐标进行 线性回归,得出实验结果如图 1。 实验结果表明:线性方程为 Y=1.564X-1.8635, R2 =0.9972,线性良好。

2.2 多肽标准曲线对照品溶液

精密称取牛血清白蛋白 10 mg,加 去离子水溶解,而后转移至 50 mL 容量瓶中定容,备 用。 碱 性 铜 试 液 配 制:精 密 称 取 烘 干 后 的 NaOH10.0 g、Na2CO3 50 g,加水 400 mL 溶液,备用, 作 为 A 液;再 取 酒 石 酸 钾 钠 0.5 g、五 水 硫 酸 铜 0.25 g,加水 80 mL 溶解,作为 B 液。使用时 A 液、B液混合定容至 500 mL 即得碱性铜试液。

福林酚试液配制:取乌酸钠(Na2WO4·2H2O) 50 g、钼酸钠 12.5 g,加水 500 mL 置于 2000 mL 圆底 烧瓶内,再加入 35% 磷酸溶液 25 mL、盐酸(质量分 数为 38.5%)50 mL,然后至于加热套内冷水回流加 热,沸腾后计时,保持微沸 10 h,再加硫酸锂 25 g、去 离子水 50 mL,摇匀,然后加 0.2 mL 溴,敞口加热挥 发多余的溴,保持沸腾 15 min,放凉,倒出,过滤,置 于棕色容量瓶内,然后定容至 500 mL,备用。 精 密 量 取 对 照 品 溶 液 0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、 1.0 mL,分别置具塞试管中,各加水至 1.0 mL,再分 别加入碱性铜试液 1.0 mL,摇匀,各加入福林酚试 液 [ 取福林试液储备液(1 → 16)]4.0 mL,立即混匀, 置 55 ℃水浴中反应 5 min,取出,置冷水浴中冷却 10 min,照紫外 - 可见分光光度法 (《中华人民共和 国药典》2015 年版一部附录Ⅴ A),以 0 号管为空白, 在 650 nm 波长处迅速测定吸光度。以吸光度为纵 坐标,牛血清白蛋白含量为横坐标,绘制标准曲线, 并计算线性回归方程,结果如图 2。

3 结论

采用 DA201-C 树脂对地龙酶解液进行 吸附工艺考察,通过静态吸附和动态吸附工艺考 察,得出最佳吸附条件。并进行验证得出采用最佳 吸附条件进行实验,地龙活性肽吸附率可以达到 89.65%。 大孔树脂对物质吸附原理为范德华力,利用 物质间极性差异和在不同溶剂的溶解度进行分离。 多肽由氨基酸组成,氨基酸由于侧链基团不同极性 具有差异,因此不同氨基酸组成的多肽之间极性差 异明显,正是利用此特点本实验结合大孔树脂对物 质的吸附原理结合多肽特点进行实验,为后期多肽类物质的纯化研究做好基础。



 


免责声明:文章仅供学习和交流,如涉及作品版权问题需要我方删除,请联系我们,我们会在第一时间进行处理。