解析肾透明细胞癌增殖的过程和影响因素！

肾细胞癌约占成人恶性肿瘤的 2%，其中肾透明 细胞癌占所有肾细胞癌的 80% ～ 85%，且近几十年来 其发病率不断上升。在最初的诊断中，20% ～ 30% 的肾细胞癌患者有转移，转移仍是肾细胞癌相关死亡 的主要原因。目前，手术是治疗肾细胞癌的首选方式， 但术后复发率约为 30%。此外，肾细胞癌对化疗/ 放疗和靶向治疗方案均不敏感。因此，迫切需要探 索新的基因以揭示肾透明细胞癌的分子机制，为诊断 和治疗提供新的线索和策略。

1 材料与方法

1．1 材料与试剂

肾 透 明 细 胞 癌 细 胞 株 ( 786-O、769-P、OSＲC-2、 CAKI-1) 购自 ATCC 细胞库，ＲPMI1640 培养基、optiMEM 培养基，McCoy’s 5A 培养基、0． 25%胰蛋白酶、PBS、B27 和胎牛血清购自美国 Gibco 公司，TＲIM2 过 表达质粒由上海生工工程有限公司合成，CCK-8 试剂 盒购自美国 MedChemExpress 公司，划痕插件购自德国 Ibidi 公司，低黏附 24 孔板购自美国康宁公司，TＲIzol 购自日本 TaKaＲa 公司，TＲIM2 一抗购自美国 Proteintech 公司，C-MYC、0CT-4、NANOG 一抗购自美国 Abcam 公 司，Lipofectamine 3000 转染试剂盒购自美国 Invitrogen 公司，GAPDH 一抗、BCA 法蛋白浓度测定试剂盒购自 上海碧云天公司，表皮生长因子( EGF) 、碱性成纤维生 长因子( bFGF) 购自美国 Sigma 公司，二抗山羊抗小鼠 IgG 抗体和山羊抗兔 IgG 抗体购自北京中杉金桥生物 技术有限公司。

1．2 TＲIM2 高表达和低表达肾透明细胞癌患者生存曲线分析

登录 THE HUMAN PＲOTEIN ATLAS 数据库( www． proteinatlas．org) ，输入 TＲIM2，即可显示 TＲIM2 高表达 和低表达肾透明细胞癌患者生存曲线分析结果。

1．3 免疫组化检测肾透明细胞癌和癌旁组织 TＲIM2 的表达

取 2017－2018 年本科临床诊断为肾透明细胞癌 的患者并行手术切除的肾癌及其癌旁组织( 距癌组织 约 3 cm) ，石蜡包埋组织后将石蜡包块切成 4 μm 的小 切片，然后脱蜡和水化，PBS 中洗涤充分，用柠檬酸抗 原修复液进行热抗原修复，PBS 充分洗涤。3%双氧水 避光室温孵育 20 min 灭活内源性过氧化物酶活性， 3%BSA 室温下封闭 20 min，加 TＲIM2 一抗，将切片平 放于湿盒中在 4 ℃冰箱中孵育过夜。次日，取出湿盒， 切片用 PBS 洗 3 次，每次 3 min，再滴加二抗覆盖组 织，室温下孵 育 30 min。玻 片 PBS 洗 涤 3 次，每 次3 min。稍甩干后滴加 DAB 显色液，显微镜下 5 min， 棕黄色为阳性，即可用自来水冲洗切片终止显色，用自 来水冲洗，然后苏木精分化液分化 3 s，自来水冲洗 3 min，用苏木精返蓝液返蓝，然后自来水冲洗。脱水， 将切片晾干，滴加适量中性树胶封片，显微镜下拍照。

1．4 细胞培养及过表达质粒转染

786-O、769-P、OSＲC-2 均用 90% ＲPMI1640 培养 基+ 10% FBS + 1% 双抗配制成的细胞培养基培养; CAKI-1 用 90% McCoy’s 5A 培养基+10% FBS+1%双 抗配制成的细胞培养基培养。用 6 cm 培养皿进行转 染，待细胞生长至 70% ～ 80% 最佳。转染前 1 d，用 4 mL 相应培养基( 10% FBS，无双抗) 换液。将 6 cm 培养皿中的培养基吸出，用无血清的 opti-MEM 培养 基清洗2 次，再加入 3 mL 无血清的 opti-MEM 培养基 后，放置于恒温恒湿培养箱（上海一恒LHS-50CH恒温恒湿培养箱）中。配置溶液 A 和溶液 B，溶液 A: 取 2 个1．5 mL EP 管，分别加入 0． 5 mL opti-MEM 培 养基( 一个为目的，另一个为对照) ，再分别加入5 μL Lipofectamine 3000，轻轻混匀; 溶液 B: 取 2 个1．5 mL EP 管，分别加入 0．5 mL opti-MEM 培养基( 一个为目 的质粒，另一个为对照空载体质粒) ，分别加入 5 μL P3000，再向一个 EP 管中加入 5 μg 目的质粒，另一个 加入 5 μg 空载体质粒，室温孵育 5 min。将溶液 A 逐 渐加入到溶液 B 中，室温孵育 20 min。直接将 A+B 复 合物加入到相应 6 cm 培养皿中，8 h 后观察细胞，更换 为相应含 10%FBS 的完全培养基。

2 结果

在 THE HUMAN PＲOTEIN ATLAS 数据库中，发现 TＲIM2 高表达的肾透明细胞癌患者生存时间明显比 TＲIM2 低表达患者长( P＜ 0．001，图 1A) ，说明 TＲIM2 高表达肾癌患者的预后较好。在临床手术切除的肾透 明细胞癌患者的肿瘤及相应癌旁肾组织标本中，免疫 组化染色结果显示，与癌旁组织比较，TＲIM2 在肾透 明细胞癌组织中明显低表达( 图 1B) 。


3 讨论

肾细胞癌全球每年有 40 万新诊患者，并导致14万人死亡，肾细胞癌约占成人恶性肿瘤的 2%，其中肾 透明细胞癌约占所有肾细胞癌的 75%。目前，由 于肾透明细胞癌对各种放化疗和靶向药物不敏感，手 术切除仍是肾透明细胞癌的主要治疗方法。然 而，在行肾切除术后，仍有 30% 的患者发生远处转移。因此，研究肾透明细胞癌发生、发展的分子机 制尤其重要，了解某些分子对肾透明细胞癌的增殖、迁 移和干性的影响对开发肾透明细胞癌的早期诊断和新 的治疗方法具有重要意义。