酸枣仁药材UPLC指纹图谱研究

酸枣仁是鼠李科植物酸枣 Ziziphus jujuba Mill. var. spinosa（Bunge）Hu ex H. F. Chou 的干燥成熟种 子 ，主要分布在我国辽宁、河北、河南、山东、 山西等地区。中医临床常以酸枣仁为君药组方治 疗虚烦不眠、惊悸多梦、体虚多汗、津伤口渴等 症。研究表明，酸枣仁含有皂苷类、黄酮类、生 物碱、脂肪酸、氨基酸、酸枣多糖及微量元素，具有镇静、催眠、降压、降血脂等多种药 理作用 。由于其良好的疗效及广泛的临床应 用，市场需求量增大、价格上涨，导致出现伪品 及掺伪品。目前，酸枣仁药材甄伪鉴别主要依赖 于性状、显微及薄层色谱鉴别，而理枣仁色泽质 地与酸枣仁极为相似，且有学者认为理枣仁亦含 有酸枣仁的主要有效成分 ，带来了甄别上的困 难，故急需在指纹图谱技术指导下开展全成分质 量控制研究。

1 材料

1. 1 仪器

Waters 高效液相色谱仪（美国 Waters 公司，PDA 检测器），Empower 3.0 色谱工作站。 Waters ACQUITY UPLCTM I-Class型超高效液相色谱 仪；沃特世超高效液相飞行时间高分辨质谱联用 系统（Xevo G2-XS Q-TOF MS），UNIFI 1.8 工作站 （英国曼彻斯特Waters公司）；ME204E万分之一分 析天平、XP26百万分之一分析天平（瑞士梅特勒— 托利多公司）； KQ-500DE 数控超声波清洗器（昆 山市超声仪器有限公司）；一恒HWS28恒温水浴锅（上 海一恒科技有限公司）；Milli-Q Direct超纯水系统 （美国默克股份有限公司）。

1. 2 试剂

乙腈（默克股份有限公司，色谱纯）； 甲酸（天津市科密欧化学试剂有限公司，色谱 纯）；甲醇（天津市富宇精细化工有限公司，分析 纯）；水为超纯水；斯皮诺素（批号：B221711108， 含量：98%，中国食品药品检定研究院）；木兰花 碱（批号：150813，含量：≥ 98%，成都普菲德生 物科技有限公司）。

1. 3 试药

酸枣仁药材S1 ~ S18为鼠李科植物酸 枣 Ziziphus jujuba Mill.var. spinosa（Bunge）Hu ex H. F. Chou的干燥成熟种子，理枣仁药材L19 ~ L23为 鼠李科植物滇刺枣zizyphuo mauritsana Lam.的干燥 成 熟 种 子 ， 见 表 1。 酸 枣 仁 对 照 药 材（批 号 ： 121517~201604，中国食品药品检定研究院），经广东一方制药有限公司质量中心鉴定。

2 方法与结果

2. 1 液相色谱及质谱参数

2. 1. 1 UPLC 条件

色谱柱为 Waters Cortecs T3 （100 mm × 2.1 mm，1.6 μm）。以乙腈（A）—0.05% 甲酸溶液（B）为流动相进行梯度洗脱：0~7 min， 3%~15% A；7~10 min，15%~17% A；10~15 min， 17% ~17% A； 15~20 min， 17% ~25% A； 20~25 min，25%~90% A。柱温：35 ℃；检测器：PDA； 检测波长：254 nm；流速：0.4 mL/min；进样体 积：1 μL。

2. 1. 2 质谱参数

氮气作为质谱离子源的雾化、 锥孔气；电喷雾电离正离子模式；毛细管电压： 2.0 kV；锥孔电压：40 V；离子源温度：120 ℃； 脱溶剂气温度：450 ℃；脱溶剂气流速：800 L/h； 扫描时间：0.5 s；扫描时间间隔：0.02 s；质荷比 范围：50∶1 200；数据采集模式：ESI（+/-）下采集 MSE ；以甲酸钠溶液校正质量轴，以亮氨酸脑啡肽 （leucine-enkephalin）为内标校正质量精度，锥孔气 体流量：50 L/h。 2. 2 混合对照品溶液的制备 精密称取斯皮诺 素、木兰花碱对照品适量，用甲醇配制成每1 mL 含斯皮诺素 20 μg、木兰花碱 15 μg 的混合对照品 溶液。

2. 3 供试品溶液的制备

取酸枣仁药材粉末（过 65目筛）1.0 g，精密称定，置于锥形瓶中，加体积分数 70%甲醇 20 mL，称定质量，加热回流提取 60 min，放冷。再称定质量，用体积分数70%甲醇 补足减失的质量，摇匀，滤过，即得。

2. 4 方法学考察

2. 4. 1 精密度试验

取“2.3”项下的供试品溶 液，按“2.1”项下的液相色谱条件连续进样测 定，记录指纹图谱。结果显示，各色谱峰的相对 保留时间相对标准偏差（RSD，sR）均＜3%，相对峰 面积sR均＜5%，表明仪器精密度良好。

2. 4. 2 重复性试验

按“2.3”项下的方法制备供 试品溶液6份，“2.1”项下的液相色谱条件进样测 定，记录指纹图谱。结果显示，各色谱峰的相对 保留时间sR均＜3%，相对峰面积sR均＜5%，表明 该方法重复性良好。

2. 4. 3 稳定性试验

取“2.3”项下的供试品溶 液，按“2.1”项下的液相色谱条件分别在 0、2、 4、6、8、12 h进样测定，记录指纹图谱。结果显 示，各色谱峰的相对保留时间sR均＜3%，相对峰 面积sR均＜4%，表明供试品溶液在12 h内稳定性 良好。

2. 5 结果与分析

2. 5. 1 酸枣仁色谱峰的液相色谱—质谱（LC-MS） 鉴定

酸枣仁及理枣仁药材的指纹图谱比较。 本研究按拟定的液相色谱及质谱条件，通过对照 品比较和 UPLC-Q-TOF-MS 技术共鉴定了药材中 的9个色谱峰，包括了3个生物碱类和6个黄酮类 成分，其中峰 7、峰 8 分别为 R 型或 S 型的 N-glcindoleacectic Acid， 峰 9 为 木 兰 花 碱 ， 峰 12 为 Isospinosin，峰 13 为斯皮诺素，峰 20 为 6'''- pcoumaloylspinosin，峰21为6'''-feruloylspinosin，峰 22、峰 23 分别为 R 型或 S 型 6''-O-（3-glc-indoleacetyl）spinosin。由于斯皮诺素色谱峰的保 留时间适中且分离度良好，并且是酸枣仁主要的 活性成分，所以确定以斯皮诺素为参照峰（S），计 算其它色谱峰的相对保留时间及相对峰面积。19 批酸枣仁药材和5批理枣仁药材的相对峰面积结果。

2. 5. 2 酸枣仁药材及理枣仁的 UPLC 指纹图谱相 似度分析

由图1可知酸枣仁与理枣仁药材的指纹 图谱较为相似，说明酸枣仁与理枣仁的化学成分 较为相似，与报道的较为相似 。因此，需 要进一步对酸枣仁与理枣仁进行鉴别。将收集于不同产地的 18 批酸枣仁药材和 5 批理枣仁药材样 品的UPLC指纹谱图数据导入中药色谱指纹图谱相 似度评价软件，以酸枣仁对照药材为参照图谱并 计算24批药材的相似度。结果显示酸枣仁药材的 相似度较高，均大于0.97，而理枣仁药材的相似度 较低，均小于0.90

3 讨论

本课题组前期实验对酸枣仁药材进行了甲 醇、50%甲醇、70%甲醇、稀乙醇及70%乙醇等溶 剂考察，结果以 70%甲醇提取色谱峰数目较多、 峰形较好且溶剂效应较小，故本研究选择 70%甲 醇为溶剂。结合研究，前期实验选取了204、 335、254 nm等波长进行对比研究，结果204 nm波 长下的色谱图基线漂移，335 nm 波长下的峰信息 较少，以波长为254 nm的色谱图基线平稳且峰信 息容量较大，故本研究选择 254 nm 波长。另外，本研究选取了乙腈—水、乙腈—0.05%乙酸、乙腈 —0.05%甲酸等流动相进行对比，结果显示以乙腈 —水为流动相的色谱图部分色谱峰拖尾严重，以 乙腈—0.05%甲酸为流动相的色谱图分离效果最佳。



 

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