烟草产香酵母香气成分分析(上海一恒HWS-12使用

0 引言

近年来，生物发酵技术快速发展，且在烟草 行业中已有广泛应用． 烟叶发酵有助于降低其 刺激性和异味，使香气突显、余味舒适、吸味醇 和，烟叶质量明显提高． 目前，关于利用微 生物发酵技术制备香料的研究较多． 德国科学 家 1994 年研究发现，将根霉和假单轴霉的个别 菌种的发酵培养物用于处理烟叶，具有增加烟 叶香气质和香气量的作用． 吕欣等从烟叶 表面筛选得到的产香菌，可快速发酵产香． 经增 香微生物处理后，烤烟烟叶烟气浓度、香气量、 细腻感等主要理化指标均有不同程度的改善．

1 材料与方法

1． 1 主要材料、试剂和仪器

主要材料与试剂: 烟末，郑州卷烟厂提供; 萄葡、苹果等市售新鲜水果，购自郑州市水果市 场; 二氯甲烷、葡萄糖、无水 Na2 SO4，天津市致 远化学试剂有限公司产; 乙酸苯乙酯，上海梯希 爱化成工业发展有限公司产; 蛋白胨、酵母组基 因 DNA 提取试剂盒，上海生工生物公司产; 酵母 粉，英国OXOID 产． 主要仪器: EL204 型电子天平，梅特勒 － 托 利多仪器有限公司产; HZQ － 211C 型落地恒温 振荡器、HWS － 12 型电热恒温水浴锅，上海一 恒科学仪器有限公司产; LX － C35L 型压力蒸 汽灭 菌 锅，合肥华泰医疗设备有限公司产; SW － CJ － 2D 型无菌操作台，苏州净化设备有 限公司产; Agilent6890 － 5973 型气相色谱 － 质 谱联仪，安捷伦科技有限公司产; SHL － D( Ⅲ) 循环水式真空泵，郑州凯鹏实验仪器有限公司 产; SHSL 型调温电热套，天津泰斯特仪器有限 公司产．

1． 2 实验方法

1． 2． 1 培养基的构成

活化培养基: 酵母粉 10 g，葡萄糖20 g，蛋白胨 20 g，蒸馏水 1 L． 种子培养基: 水 100 mL，烟末 10 g．WL 鉴别培养基: KCl 0． 042 5% ( 如无特 指，文中百分数均为质量分数) ，FeCl3 0． 002 2%， CaCl2 0． 012 5% ，MgSO4 0． 012 5% ，MnSO4 0． 000 25% ，溴 甲 酚 绿 0． 002 2% ，KH2PO3 0． 055% ，酵母浸粉 0． 5% ，胰蛋白胨 0． 5% ，葡 萄糖 5% ，琼脂 2% ，调 pH 至 6． 5，于 121 ℃ 条 件下灭菌 20 min．

1． 2． 2 产香菌株的分离筛选

分别将不同种 类的新鲜水果取皮 5 g，放置于盛有 100 mL 无 菌水的锥形瓶中． 于28 ℃，摇床170 r /min 条件 下培养 20 ～ 30 min，使得水果果皮表面的微生 物转移至无菌水中，取出静置 5 min． 然后进行 梯度稀释，将稀释液各取1 mL 接入活化培养 基． 在培养过程中，观察菌落的形态，挑选酵母 菌株并使用平板划线法分离和纯化． 移取一环筛选出的酵母菌株，接入活化培 养基，于 28 ℃，摇 床 170 r /min 条 件 下 培 养 24 h． 将培养好的酵母菌液按料液比 1∶10 接 入预先配制好的无菌种子培养基中，在 28 ℃， 170 r /min 条件下培养 72 h，制得发酵液． 重复 上述步骤，制取多组酵母菌种发酵液． 同时，将 10% 无菌水添加到无菌种子培养基，作为空白 对照组． 每组酵母菌种发酵液和空白对照组均 制备 3 组，用于平行实验． 培养过程中观察并记 录发酵液香味变化，根据感官嗅辨结果，选出最 好的一株．

1． 2． 3 产香菌株的鉴定

1． 2． 3． 1 菌株的形态学鉴定

在 28 ℃条件下 培养 1． 2． 2 筛选出的酵母菌株 48 h，然后挑取 单菌落，于 WL 培养基上进行平板划线，再置于 28 ℃ 恒温培养箱中培养 5 d，对其菌落形态进 行观察，同时进行显微形态观察．

1． 2． 3． 2 菌株的分子生物学鉴定 

根据酵母 基因组 DNA 提取试剂盒说明进行菌株 DNA 提 取，以 ITS1 和 ITS4 分别作为上、下游引物，进 行 5． 8s － ITS 区基因序列扩增． PCＲ 反应体系如下: 2 × TaqMasterMix 为 25 μL，DNA 模板为 2 μL，ITS1 为 1 μL，ITS4 为 1 μL，ddH2O 为 21 μL，总体系为 50 μL． PCＲ 反应程序见表 1．

将 PCＲ 扩增产物送至上海生工生物公司 进行测序分析，分析结果对照 NCBI 数据库进 行产香菌株的鉴定．

1． 2． 4 产香酵母发酵液香气成分分析

利用 分子生物学鉴定出的产香酵母菌株进行发酵液 制备，同时制备对照组，设定 3 组平行实验． 将 发酵好的样品进行蒸馏萃取，然后进行水浴浓 缩，过滤后导入浓缩瓶中，加入 1 mL 内标物 ( 乙酸苯乙酯，0． 6 mg /mL) ，将其置于接有冷凝 管的水浴锅中，于 60 ℃下浓缩至 1 mL，轻轻摇 动，并用 1 mL 一次性无菌注射器抽吸，通过 0． 22 μm过滤膜过滤到样品瓶中． 重复上述操 作，将所有样品旋转蒸发保存． 对各样品的香气 成分采用 GC-MS 进行表征，以具体分析各样品 香味特征的可能主要来源． 对照组发酵液香气 成分分析方法同上． GC-MS 分析条件如下． 气相 条 件: 色 谱 柱 HP － 5，进 样 口 温 度 260 ℃，进 样 量 1 μL，分 流 比 10 ∶ 1，延 迟 5 min，升温程序为 50 ℃ 保 持 2 min，然 后 以 6 ℃ /min 的速度升到 280 ℃，持续 10 min． 质谱条件: Aux 260 ℃，四级杆温度 150 ℃， 离子源温度 230 ℃，质量扫描范围30 ～ 550 amu

2 结果与分析

经过分离筛选得到 38 株酵母，将其分别酵，并与对照组进行嗅辨分析，筛选出一株能够 使烟末发酵液产生明显花香韵和甜香韵，且区 别于对照组的酵母菌株 YG － 4，该菌株来源于 巨峰葡萄的表皮．将得到的长度为 723 bp 的 16S rＲNA 基因 序列提交到 NCBI，采用 BLAST 程序与已知序 列进行 相 似 性 分 析，NCBI 接 收 号 lcl | Query _ 47589． 结果发现，接近种类 Hanseniaspora uvarum，相似度 98%，覆盖率 99% ． 由此可知，产香 酵母 YG － 4 与 Hanseniaspora uvarum 具有高度的 同源性，结合形态学鉴定结果，将产香酵母 YG － 4 鉴定为汉逊酵母菌属( Hanseniaspora． sp) ．与 空白对照组相比，产香酵母 YG － 4 发酵液中的 酯类、羰基类、酸类、烃类物质含量降低． 分析其 原因可能是在利用产香酵母 YG － 4 发酵过程 中，菌落中部分酶水解，伴随着处理时间过长、 温度设置较低等问题，造成这部分物质含量降 低． 产香酵母 YG － 4 发酵液中的醇类物质含量 增加明显，杂环中的 1 － 苯基 － 3 － 氨基吡唑也 略有增加． 从整体上分析，虽然部分香气物质含 量有所降低，但是苯甲酸苯乙酯、2 － 戊烯酸、 1 － 苯基 － 3 － 氨基吡唑、苯乙醇含量均有所增 加． 苯甲酸苯乙酯带有蜜样香气，2 － 戊烯酸带 有酸甜果香，苯乙醇带有清甜的玫瑰样花香，这 些香味成分含量的增加有助于改善发酵液香 味，产生不同于对照组的特征香味．

3 结论

从巨峰葡萄表皮分离筛选得到一株能 够使烟末发酵液产生明显花香韵和甜香韵、且 区别于对照组的酵母菌株 YG － 4，对该菌株进行形态学鉴定和分子生物学鉴定，确认该菌株 为汉逊酵母菌． 利用该菌株发酵制备得到的烟 末发酵液与空白对照组对比，虽然有部分香气 成分含量降低，但是苯乙醇、苯甲醛苯乙酯、2 － 戊烯酸、1 － 苯基 － 3 － 氨基吡唑含量均有所增 加，可能对于发酵液香味有所改善，产生不同于对照的特征香．



 

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