乳杆菌的降胆固醇特性研究(一恒DHP-9082使用)

半个世纪以来，心脑血管疾病已成为威胁人类健 康的首要疾病，其死亡率已超过所有癌症的总和。流 行病学和临床调查表明，高胆固醇是引发该疾病的重 要因素之一，降低血清胆固醇水平，特别是低密度脂 蛋白水平，能显著降低该疾病的发病率和死亡率。 某些乳酸菌菌株，能够促进胃肠道吸收，增加肠道有 益菌群，改善人体胃肠道功能，抑制腐败菌的繁殖，提 高机体免疫力等重要生理功能。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

酸菜汁液：采自黑龙江佳木斯市农家发酵酸菜，采 集样品于离心管内，加入无菌甘油使终浓度为 25 %， 于-80 ℃冰箱保存。 MRS 培养基：北京陆桥技术股份有限公司；MRSCHOL 培养基：胆固醇 1.0 g，加 1 mL 吐温-80 助溶， 加入 1 000 mL MRS 液体培养基中，调 pH 值至 7.0。 革兰氏染色试剂盒、乳酸菌生化鉴定试剂盒：北 京陆桥技术股份有限公司；细菌基因组 DNA 提取试剂 盒、引物、TE 缓冲液、DNA Marker 、ddH2O、Mix 液：天 根生化科技有限公司；牛胆盐、胆固醇（99 %）：美国 sigma 公司；邻苯二甲醛、氯化钠、盐酸、冰乙酸、正己 烷、无水乙醇、氢氧化钾等试剂均为分析纯级：国药化 学试剂集团。

1.2 主要设备及仪器

一恒DHP-9082 恒温培养箱：上海一恒科学仪器有限 公司；HDL 超净工作台：北京东联哈尔仪器制造有限公司；GL124-1SCN 万分之一分析天平：赛多利斯科学 仪器（北京）有限公司；LDZX-50KB 立式压力蒸汽灭火 器：上海申安医疗器械厂；PHS-3C 雷磁 pH 计：上海精 密科学仪器有限公司；SHB-III 循环水式多用真空泵： 上海振捷实验设备有限公司；CX41RF 显微镜：日本奥 林巴斯公司；TP600 梯度 PCR 仪：日本 TAKARA 公司； Sigma-3K15 离心机：德国 SIGMA 科技有限公司；UV2600 紫外可见分光光度计：岛津仪器有限公司；DYY6C 电泳仪：北六一仪器厂。

1.3 试验方法

1.3.1 乳酸菌的初步分离纯化

将带回的酸菜汁液解冻，以备使用。采用梯度平 板稀释法，吸取酸菜汁液于 0.85 %理盐水中进行梯度 稀释，然后涂布于含 0.5 % CaCO3 的固体 MRS 培养基 上，37 ℃静置培养 48 h，挑选平板上有明显透明圈的 菌落，在 MRS 平板上多次划线纯化直至菌落形态单 一，挑取单菌落到 MRS 液体培养基增菌培养 24 h，记 录菌落特征，于 4 ℃冰箱存储备用。

1.3.2 生理生化鉴定试验

对菌株进行革兰氏染色、过氧化氢酶试验、采用 乳酸菌生化鉴定试剂盒做碳水化合物（蔗糖、甘露醇、 山梨醇、水杨苷等）发酵试验。

1.3.3 菌种 16S rDNA 鉴定

试验采用细菌基因组 DNA 试剂盒提取细菌 DNA，利 用 引 物 27F （5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3'）、 1492R （5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'） 进行扩 增；聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR） 反应程序为：95 ℃预变性 4 min；95 ℃变性 45 s，50 ℃退 火 45 s，72 ℃延伸 2 min，循环 30 次；72 ℃延伸 10 min， 4 ℃保存。PCR 产物经 1 %琼脂糖电泳分析后，送交华 大基因公司进行 16S rDNA 测序，所得序列在 NCBI 中 进行比对，确定菌种。

1.3.4 降胆固醇乳酸菌的筛选

绘制胆固醇标准曲线：取 1 mL 的配制质量浓度为 0.02、0.05、0.10、0.12、0.15、0.20 mg/mL 的 胆 固 醇 系 列 标准溶液，加入 3 mL 95 %乙醇、2 mL 50 %氢氧化钾， 旋涡振荡混匀。于 60 ℃下恒温水浴 10 min ，冷却后加 入 5 mL 正己烷，旋涡振荡萃取 1 min~2 min，加入 2 mL蒸馏水，振荡均匀，静置分层。吸取 2 mL 上层正己烷， 60 ℃水浴氮气吹干，加入 4 mL 0.5 mg/mL 邻苯二甲醛 溶液和 2 mL 浓硫酸，显色反应 20 min，测定吸光值 （A550）并绘制胆固醇标准曲线；

2 结果分析

对 100 个酸菜样本中乳酸菌进行分离培养，最终成 功分离鉴定 10 株菌，并对此 10 株菌定义编号为 M：姓氏 马+H：黑龙江缩写黑+S：酸菜+年限+编号；即 MHS1701、 MHS1702、MHS1703、MHS1704、MHS1705、MHS1706、 MHS1707、MHS1708、MHS1709、MHS1710。经培养，10 株 菌菌落呈中等大小，有凸起，乳白色，湿润，明显溶钙 圈，边缘整齐，菌落呈圆形，且挑取时具有黏性。MHS1704 不发酵山梨醇，MHS1710 不水解蔗糖。 根据查阅《伯杰氏细菌鉴定手册》，乳杆菌属细菌可利 用的碳源有葡萄糖、甘露糖、果糖、半乳糖、糊精、七叶 苷、纤维二糖、麦芽糖、甘露醇、水杨苷、山梨醇、蔗糖、棉子糖、乳糖等 ，结合试验结果分析，初步判断 10 株 菌均为乳酸杆菌属。采用细菌 DNA 基因组试剂盒提取 10 株菌株基因 组 DNA，产物通过 PCR 扩增，1 %琼脂糖凝胶电泳检测，最终检测电泳图有且只有一个条带，标准 Marker 条带为 2 000 bp，各菌株条带在 1 000 bp 左右。菌株 DNA 提取产物条带单一，且与预期目的大小一致，可 以满足后续测序要求。

3 结论

本试验从传统东北发酵酸菜中分离获得植物乳 杆菌、棒状乳杆菌、干酪乳杆菌及短乳杆菌共 10 株菌； 要求筛选出的乳酸菌除了具备特定的降胆固醇功能 以外，还必须具有益生菌所共有的优良特性，试验表 明各菌株在 pH 值为 3.0 的环境以及 3 g/L 的胆盐浓度 下具有一定的耐受性；各菌株胆固醇脱除率在 9 %～ 60 %之间，MHS1701、MHS1703、MHS1706 菌株的胆固 醇清除能力分别达 41 %、53 %、41 %，且 MHS1701 的 耐酸耐胆盐能力最强。因此传统东北酸菜可以作为降解胆固醇乳酸菌的来源库，通过体外培养筛选得到的 植物乳杆菌 MHS1701 的功能特性最明显，有实际应用价值。



 

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